亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法

摘要

本发明公开了属于生物酶及酶制剂的制备技术领域的一种亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法。将产生亚硝酸还原酶的巨大芽孢杆菌进行活化制备成种子，获得的种子培养液以1－10％的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为5.0－7.5，在25－40℃、转速100－240r/min下恒温培养20－36h，得到菌悬液，菌悬液用磷酸缓冲液重新悬浮得到菌体，菌体细胞经超声波破碎，冷冻离心上清液即为粗酶液，粗酶液经分离纯化可得到不同浓度、纯度的亚硝酸盐还原酶，加入酶保护剂制成液体酶制剂，应用本发明获得的亚硝酸还原酶制剂，酶活力为4000－8000U/mL。本制备方法简便，生产周期短，维护公共食品安全。

主权项

1.一种亚硝酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述亚硝酸还原酶的制备是采用发酵技术制备的，制备方法包括以下步骤：(1)将产生亚硝酸盐还原酶的巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriumMPF-906)干菌粉溶解于生理盐水中，接种于斜面种子培养基，获得活化菌种，其中巨大芽孢杆菌干菌粉∶生理盐水＝1∶2-5(重量比)；再将该活化菌种接种于种子培养基中获得种子培养液；(2)将步骤(1)获得的种子培养液以1-10％的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为5.0-7.5，在25-40℃、转速100-240r/min下恒温培养20-36h，得到菌悬液；(3)菌体细胞的收集，将步骤(2)获得的菌悬液摇瓶发酵液在离心率为10000-20000×g、1-4℃冷冻离心10-20min，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体；(4)菌体细胞的超声波破碎，将提取的菌体细胞，按1000mL培养液菌体细胞加入50-100mM，pH6.5-7.5的100mL磷酸缓冲液，超声波破碎，超声波条件为180-220w，超声2-10s，间歇9-15s，60-120次，在离心率为26000×g、4℃冷冻离心15min，上清液即为粗酶液；(5)将粗酶液分离提取，得到亚硝酸还原酶。