兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因重组杆状病毒及疫苗

摘要

本发明涉及兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白重组杆状病毒及基因工程疫苗，属于生物制药领域。通过RT－PCR扩增兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60全基因，通过分子生物学技术构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，使VP60基因获得表达，然后以重组杆状病毒表达的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60作为抗原，加上相应的佐剂制成兔病毒性出血症的基因工程疫苗。本发明可以提供一种免疫效果好、工艺简便的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因工程疫苗，用于预防控制兔病毒性出血症。

主权项

1.兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因重组杆状病毒，其特征是，由以下步骤构建而成：1)兔病毒性出血症病毒总RNA的提取用焦碳酸二乙酯DEPC水按体积比1∶10加入发生兔病毒性出血症的兔肝脏组织中，研磨成悬液，装入用DEPC处理过的1.5mL EP管中，于-20℃反复冻融3次，在高速冷冻离心机上，以7200r/min，离心20min，取上清200μL，加入Trizol 800μL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿210μL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃，10000r/min离心15min，取上层水相750μL，加入0.5mL异丙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃ 10000r/min离心10min，去上清，缓缓加入75％乙醇1mL洗涤，4℃ 8000r/min离心5min，去上清，室温干燥20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解；2)设计合成以下引物：P1：5’-ATAGTCGACATGGAGGGCAAAG-3’ Sal IP2：5’-GCCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCA-3’ Xho I3)扩增衣壳蛋白VP60基因：反转录体系为：10×Buffer 2μl、10mM dNTPs 2μl、下游引物1μl、RNA酶抑制剂0.5μl、RNA模板12μl，AMV反转录酶0.5μl，DEPC水2μl，总体积为20μl，瞬间离心混匀，65℃反应15min，42℃孵育1h，95℃5min，-20℃保存备用；PCR反应体系为：10×Reaction buffer 2.5μl、25mM MgCl2 1.5μl、2.5mM dNTPS0.5μl、50mM P1 0.5μl、50mM P2 0.5μl、模板RNA 4.0μl、ddH2O 15μl、EX TaqTMpolymerase 0.5μl，总体积25μl，瞬间离心混匀，采用热盖进行PCR扩增反应：94℃变性3min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min，结束反应；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的衣壳蛋白VP60基因扩增片断大小为1740bp；4)重组杆状病毒质粒Bacmid-VP60的构建：将扩增的VP60基因先克隆入转移载体pFastBacTM1中，得到重组转移载体pFastBacTM1-VP60，然后将pFastBacTM1-VP60质粒转化含有穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞，转化产物涂于含有三种抗生素、X-gal和IPTG的LB平板，37℃培养48h后，挑选白色菌落培养并提取质粒，以此为模板，以通用pUCM13上游引物与特异性VP60下游引物进行PCR鉴定，阳性的重组质粒命名为Bacmid-VP60；5)转染：将重组杆状病毒质粒Bacmid-VP60转染Sf9细胞，经鉴定纯化获得重组病毒，并冻存于4℃、-20℃和液氮中。