| 主权项 |
1.一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于包括以下步骤：1)选定菌株、克隆载体和培养基：菌株为大肠杆菌Escherichia coli EPI-100，克隆载体为pWEBTM，培养基为LB肉汤及LB琼脂，均添加氨苄西林，培养温度为37℃；2)提取红树林土壤eDNA：称取3～6份土壤样品，分别置于离心管中，每管加入DNA提取缓冲液，漩涡至土壤颗粒分散于缓冲液中，将土壤样品振摇至土壤匀质化，每管加入十二烷基磺酸纳，混匀，55～65℃水浴，加入氯仿/异戊醇溶液抽提，离心，收集上清，在上清中加入异丙醇，沉淀，离心，收集沉淀得红树林土壤eDNA；3)红树林土壤eDNA的处理：通过脉冲场电泳选择适合构建大片段文库的eDNA片段，采用电洗脱回收、纯化，得35～45kb的红树林土壤eDNA片段；4)红树林土壤eDNA末端补平：将35～45kb的红树林土壤eDNA片段进行末端补平反应，在冰上依次加入末端补平反应体系各组分，室温下孵育，70℃下灭活末端补平酶；5)末端补平物与载体连接：将末端补平的红树林土壤eDNA连接到pWEBTM载体，在冰上依次加入连接反应体系各组分，室温下孵育，70℃下灭活连接酶，得cosmid DNA连接物；6)连接产物体外包装：将cosmid DNA连接物用MaxPlax Lambda Packaging Extracts进行体外包装反应，反应条件为：30℃，90min，反应结束后，再次加入MaxPlax Lambda PackagingExtracts，30℃，继续孵育90min，然后加入噬菌体稀释液，混匀，加入氯仿，混匀后得包装好的cosmids，保存于4℃；7)包装产物的效价测定：用包装好的cosmids感染宿主细胞Escherichia coli EPI-100，37℃孵育，将感染后的宿主细胞涂布于已添加氨苄西林LB琼脂平板，37℃，过夜培养，所有生长出的菌落均为阳性克隆子，计算克隆子数目，得红树林土壤大片段宏基因组文库；8)克隆子插入片段的验证：随机挑取至少10个LB-氨苄西林平板上的菌落，接种于LB-氨苄西林肉汤，37℃下培养，提取克隆子质粒，用BamHI限制性内切酶(TaKaRa)酶切，计算文库插入片段的大小；9)阳性克隆子的保存：将所有的阳性克隆子接种于细胞培养板，每孔含LB肉汤、氨苄西林和甘油，待克隆子长好后，将细胞培养板复制一份，均保存于-80℃。 |
