一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法

摘要

一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，涉及水处理过程中硫酸盐还原菌(SRB)的定量检测方法。现在检测方法存在检测周期较长、不能有效的和即时的指导生产实践和检测费用较高等缺点。本发明依次包括以下步骤：(1)制备“菌体前处理缓冲液”；(2)菌体的制备；(3)倍比稀释；(4)进行冰上的PCR操作；(5)PCR在扩增仪上的扩增；(6)扩增产物于1.0％的琼脂糖电泳检测；(7)结果观察，查表记数。本发明所述方法记数结果准确、可有效的缩短计数时间、真实的反映生产实际情况、降低检测费用，利于推广应用。

主权项

1.一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于它依次包括以下步骤：(1).制备菌体前处理缓冲液；(2).菌体的制备；(3).倍比稀释；(4).进行冰上的PCR操作；(5).PCR在扩增仪上的扩增；(6).1.0％的琼脂糖电泳检测；(7).结果观察，查表记数；所述“(4).进行冰上的PCR操作”过程中的PCR反应体系为20μl：包括：10×Buffer2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、浓度为0.1μmol·L-1 的正向引物SRBF1μl、浓度为0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去离子水11.7μl，然后加2μl的样品，其中正向引物SRBF的碱基组成为：5’-CCTGACGCAGCGACGCCG-3’，共18bp；反向引物SRBR的碱基组成为：5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’，共19bp；所述(5).“PCR在扩增仪上的扩增”程序为：94℃预热5min，94℃变性30s，58.8℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min；所述(1).制备“菌体前处理缓冲液”过程中，“菌体前处理缓冲液”的母液成分为：70g NaCl、2g KCl、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰SDS；将母液稀释10倍成为菌体前处理缓冲液；控制工作液的pH为7.5，在121℃条件下灭菌15～30min后即可；所述(2).菌体的制备过程依次包括以下步骤：a.将用含有高纯氮气的厌氧管取回的油田污水的水样，或生物反应器的污泥，取1mL注入到经灭菌的1.5mL的离心管中；b.对油田污水的水样在震荡器上充分震荡3～6min，对生物反应器的污泥在震荡器上充分震荡10～15min，13000r/min离心1min；从管中轻轻的弃上清液0.9mL；c.在剩余的0.1mL中加入“菌体前处理缓冲液”0.9mL，对油田污水的水样在震荡器上充分震荡3～6min，对生物反应器的污泥在震荡器上充分震荡10～15min；d.13000r/min离心2min，弃上清液0.98mL，充分震荡2min；所述(7).查询的表为每毫升稀释液的细菌近似值表。