公牛分离精子的冷冻保存方法

摘要

本发明属生物工程技术领域，提供了一种适用于公牛分离X和Y精子的冷冻保存方法。发明采用TRIS作为缓冲溶液体系，主要包括A液和B液两部分，特别例添加了有利于保持分离精子活力的成分，专门适用于分离公牛精子的冷冻保存。通过对分离精子接收、离心浓缩、平衡以及程序降温冷冻等一系过程，在保证分离精子活力能够满足人工授精和体外受精的同时，实现分离精子在-196℃的液氮中长期保存或远距离运输，并适用于商业化生产和推广。

主权项

1、一种适用于公牛分离X和Y精子的冷冻保存方法，保证经过冷冻保存的分离精子活力能够满足人工授精和体外受精的同时，实现分离精子在-196℃的液氮中长期保存或远距离运输，其特征是：a)冷冻溶液系统包括A液和B液两部分：A液和B液均用去离子蒸馏水配制，A液含有2.0～3.0％的TRIS、1.0～2.0％的单水柠檬酸、0.8～1.2％果糖和15.0～25.0％的卵黄以及0.48μg/ml太乐菌素、1.44μg/ml林肯霉素、2.88μg/ml壮观霉素、3.20μg/ml庆大霉素，B液含有3.0～3.5％的TRIS、1.0～2.0％的单水柠檬酸、1.2～1.4％果糖、15.0～25.0％的卵黄和10.0～14.0％甘油以及0.011μg/ml太乐菌素、0.033g/ml林肯霉素、0.066g/ml壮观霉素、0.055μg/ml庆大霉素；b)精子收集：按照目前已经成熟的流式细胞仪分离X和Y精子技术对采集的精子进行染色分离，接收分离精子的试管预先加入1～5ml的A液，接收分离精子后成为含有X或Y精子的溶液，其最终含有2％～6％的卵黄；c)低温平衡：将步骤b)最终得到的分离精液移到5℃平衡，平衡时间2～6小时；d)离心浓缩：步骤c)中平衡后的分离精液在5℃、3000～5000转/分钟速度下离心20分钟；离心结束后，弃去上清，留下100～200微升精子沉淀；将同一头公牛4小时内分离得到各个批次的精子沉淀汇合；e)甘油平衡：预先5℃恒温B液，按照体积1∶1与步骤d)得到的精液沉淀混合，摇匀并平衡10～15分钟；f)细管分装：在0.25ml的细管上标记好公牛号、日期、精子类型，移入5℃恒温预冷；将步骤e)得到的精液分装到0.25ml细管中并封口；g)程序降温：准备好程序冷冻仪，注入液氮并将起始温度设定在5℃，移入步骤f)所获的精液细管。开启程序降温冷冻，以6℃/分钟的速度降温到-10℃，恒温停留2分钟，然后再以6℃/分钟的速度降温，达到-80℃终止时，将细管投入液氮长期保存。