| 主权项 |
1.一种心肌特异性-合成性启动子,其包括c6-39(SeqID No:22)。 2.如申请专利范围第1项之心肌特异性-合成性启动 子,其中该心肌特异性-合成性启动子进一步包括 顺式-作用调节元件之第一-组合; 该顺式-作用调节元件之第一-组合系选自随机组 合之合成性-启动子-重组物资料库;以及 该心肌-特异性合成性启动子驱动细胞族群中可表 现基因的转录活性,该活性高于细胞族群藉由对照 -启动子所驱动之可表现基因的转录活性。 3.如申请专利范围第2项之心肌特异性-合成性启动 子,其中该顺式-作用调节元件包括SRE(SeqID No:1)、 MEF-1(SeqID No:2)、MEF-2(SeqID No:3)、以及TEF-1(SeqID No:4) 。 4.一种用于心肌细胞中表现基因之心肌特异性-合 成性表现构筑体,包括: 经操作性连结至可表现基因之心肌-特异性-合成 性-启动子,其中心肌-特异性-合成性-启动子包括c6 -39(SeqID No:22)。 5.如申请专利范围第4项之心肌特异性-合成性表现 构筑体,其中该心肌-特异性-合成性启动子进一步 包括顺式-作用调节元件之第一-组合; 该顺式-作用调节元件之第一-组合系选自随机组 合之合成性-启动子-重组物资料库;以及 该心肌-特异性合成性启动子驱动细胞族群中可表 现基因的转录活性,该活性高于细胞族群藉由对照 -启动子所驱动之可表现基因的转录活性。 6.如申请专利范围第5项之心肌特异性-合成性表现 构筑体,其中该顺式-作用调节元件包括SRE(SeqID No:1 )、MEF-1(SeqID No:2)、MEF-2(SeqID No:3)、以及TEF-1(SeqID No :4)。 7.如申请专利范围第4项之心肌特异性-合成性表现 构筑体,其中该可表现基因包括可编码出生长素释 素(GHRH)或其生物功能活性上之等同物之核酸。 8.如申请专利范围第7项之心肌特异性-合成性表现 构筑体,其中该经编码之GHRH系具有生物活性之多 ,以及该经编码之GHRH的生物功能活性等同物系 一种多,该多系经生物工程制作而含有与GHRH 多相较下同时具有相似或经改善生物活性之不 同的胺基酸序列。 9.如申请专利范围第7项之心肌特异性-合成性表现 构筑体,其中该经编码之GHRH或其生物功能活性上 之等同物具有下列序列(SEQID No:6): -X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH 其中该序列具有下述特征: X1为胺基酸酪胺酸(“Y")或组胺酸(“H")之D-或L-异 构物; X2为胺基酸丙胺酸(“A")、缬胺酸(“V")、或异白胺 酸(“I")之D-或L-异构物; X3为胺基酸丙胺酸(“A")或甘胺酸(“G")之D-或L-异 构物; X4为胺基酸甲硫胺酸(“M")或白胺酸(“L")之D-或L- 异构物; X5为胺基酸丝胺酸(“S")或天冬醯胺酸(“N")之D-或L -异构物; 或其组合。 10.如申请专利范围第4项之心肌特异性-合成性表 现构筑体"其中该心肌特异性-合成性表现构筑体 包括SeqID No:7、SeqID No:8、SeqID No:9、SeqID No:10、SeqID No:11、SeqID No:12、SeqID No:13、SeqID No:14、或SeqID No: 15。 11.一种合成心肌特异性合成性表现构筑体之方法, 包括: (a)识别一心肌-特异性启动子,其中心肌-特异性-合 成性-启动子包括c6-39(SeqID No:22);以及 (b)将该心肌-特异性启动子操作性地连结至一可表 现基因,俾形成心肌特异性合成性表现构筑体; 其中,该心肌-特异性-合成性启动子包括顺式-作用 调节元件之第一组合;以及 该可表现基因包括具有或不具有经操作性连结之 启动子的核酸表现构筑体。 12.如申请专利范围第11项之方法,其中该顺式-作用 调节元件之第一-组合系选自随机组合之合成性- 启动子-重组物资料库;以及 该心肌-特异性合成性启动子驱动细胞族群中可表 现基因的转录活性,该活性高于细胞族群藉由对照 -启动子所驱动之可表现基因的转录活性。 13.如申请专利范围第12项之方法,其中该顺式-作用 调节元件包括SRE(SeqID No:1)、MEF-1(SeqID No:2)、MEF-2( SeqID No:3)、以及TEF-1(SeqID No:4)。 14.如申请专利范围第11项之方法,其中该可表现基 因包括可编码出生长素释素(GHRH)或其生物功能活 性上之等同物之核酸。 15.如申请专利范围第14项之方法,其中该经编码之 GHRH系具有生物活性之多,以及该经编码之GHRH的 生物功能活性等同物系一种多,该多系经生物 工程制作而含有与GHRH多相较下同时具有相似或 经改善生物活性之不同的胺基酸序列。 16.如申请专利范围第14项之方法,其中该经编码之 GHRH或其生物功能活性上之等同物具有下列序列( SEQID No:6): -X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH 其中该序列具有下述特征: X1为胺基酸酪胺酸(“Y")或组胺酸(“H")之D-或L-异 构物; X2为胺基酸丙胺酸(“A")、缬胺酸(“V")、或异白胺 酸(“I")之D-或L-异构物; X3为胺基酸丙胺酸(“A")或甘胺酸(“G")之D-或L-异 构物; X4为胺基酸甲硫胺酸(“M")或白胺酸(“L")之D-或L- 异构物; X5为胺基酸丝胺酸(“S")或天冬醯胺酸(“N")之D-或L -异构物; 或其组合。 17.如申请专利范围第11项之方法,其中该心肌特异 性-合成性表现构筑体包括SeqID No:7、SeqID No:8、 SeqID No:9、SeqID No:10、SeqID No:11、SeqID No:12、SeqID No: 13、SeqID No:14、或SeqID No:15。 18.一种用于肌细胞中表现基因之心肌特异性-合成 性表现构筑体,包括: 经操作性连结至可表现基因之心肌-特异性-合成 性-启动子,其中心肌-特异性-合成性-启动子包括c6 -39(SeqID No:22)。 19.如申请专利范围第18项之心肌特异性-合成性表 现构筑体,其中该可表现基因包括可编码出生长素 释素(GHRH)或其生物功能活性上之等同物之核酸。 20.如申请专利范围第19项之心肌特异性-合成性表 现构筑体,其中该经编码之GHRH系具有生物活性之 多,以及该经编码之GHRH的生物功能活性等同物 系一种多,该多系经生物工程制作而含有与 GHRH多相较下同时具有相似或经改善生物活性之 不同的胺基酸序列。 21.如申请专利范围第19项之心肌特异性-合成性表 现构筑体,其中该经编码之GHRH或其生物功能活性 上之等同物具有下列序列(SEQID No:6): -X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH 其中该序列具有下述特征: X1为胺基酸酪胺酸(“Y")或组胺酸(“H")之D-或L-异 构物; X2为胺基酸丙胺酸(“A")、缬胺酸(“V")、或异白胺 酸(“I")之D-或L-异构物; X3为胺基酸丙胺酸(“A")或甘胺酸(“G")之D-或L-异 构物; X4为胺基酸甲硫胺酸(“M")或白胺酸(“L")之D-或L- 异构物; X5为胺基酸丝胺酸(“S")或天冬醯胺酸(“N")之D-或L -异构物; 或其组合。 22.如申请专利范围第18项之心肌特异性-合成性表 现构筑体,其中该心肌特异性-合成性表现构筑体 包括SeqID No:7、SeqID No:8、SeqID No:9、SeqID No:10、SeqID No:11、SeqID No:12、SeqID No:13、SeqID No:14、或SeqID No: 15。 图式简单说明: 第1图显示于不同合成性启动子之组合中,具有部 份调节元件之肌肉合成性启动子的实验策略及设 计,其中各组合至少含有一种肌肉特异性调节元件 ; 第2图显示于构筑体中,肌肉合成性启动子元件的 设计,该构筑体与骨骼肌-肌动蛋白488启动子(SK 488)相较下,其于体外具有最高的报导基因活性; 第3图显示萤光素之转录表现,其系以超过SK448表 现量之倍数计算,该萤光素报导基因系藉由各种 合成性启动子所驱动,且其活性系于分化后48小时 测量; 第4图显示于成年ICR小鼠之前胫肌中,萤光素之 转录表现,该转录表现系由合成性启动子SPc1-28、 SPc5-12、巨细胞病毒(“CMV")、以及SK448所驱动,该萤 光素之活性系于直接注射至前胫肌7天后测得; 第5图显示于鸡之初级肌肉培养中,-半乳糖( -gal)之转录表现,该转录表现系由合成性启动子 巨细胞病毒(“CMV")、SK448、SPc5-12、以及对照组所 驱动,该-gal之活性系于24、48、72、以及96小时进 行测量; 第6图显示于小鼠之初级心肌培养中,萤光素之 转录表现,该转录表现系由合成性启动子巨细胞病 毒(“CMV")、SPc5-12、SK448、SV40、-gal、以及未转 染细胞所驱动,该萤光素之活性系于24、48、72、 以及96小时进行测量; 第7图显示于心肌细胞中,于订定时间下测量-半 乳糖之活性的结果,其中该-gal之活性系于24 、48、72、以及96小时进行测量; 第8图显示-gal之体外肌肉特异表现,该表现系由 合成性启动子SPc5-12所驱动,其中于显示细胞类型 特异性表现中,由SPc5-12启动子所驱动之-gal表现 程度与由SK448启动子所驱动之-gal表现程度可相 互比拟,以及于数种非-肌肉细胞株(CV1, 293, HeLa与10 T1/2)中,由SPc5-12启动子所驱动之-gal表现程度系 小于由CMV启动子所驱动之-gal表现程度至少一级 之程度; 第9图显示于体内之肌肉及心肌细胞中,由合成性 启动子c5-12所驱动之-gal表现程度,使用不同系之 基因转殖鼠(其基因系与-gal cDNA探针杂合再与鼠 之18S探针杂合)之各组织(例如,睾丸(“T")、脑(“B" )、肠(“I")、肺(“Lg")、胃(“St")、肾脏(“K")、肝 脏(“LV")、腓肠肌(“M")、心脏(“H")、脾脏(“Sp")) 的总RNA北方点墨结果,显示由SPc5-12所驱动之报导 基因的肌肉与心肌特异性表现; 第10图显示由合成性启动子巨细胞病毒(“CMV")、 SPc5-12、SK448,、SV40、以及对照组所驱动之萤光素 报导基因之体内表现程度,其中该萤光素于体 内之活性系于直接注射于肌肉内后2及4星期进行 分析; 第11图显示小鼠之鼠生长素(“GH")的浓度,该生长 素系与由SPc5-12启动子所驱动之GHRH表现构筑体一 起注射至小鼠体内,与对照组启动子相比,该GH的浓 度系于注射后第7天进行测定; 第12图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c1-26的序列; 第13图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c2-26的序列; 第14图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c2-27的序列; 第15图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c5-5的序列; 第16图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c5-12的序列; 第17图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c6-5的序列; 第18图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c6-16的序列; 第19图显示具有经标记之调节元件以及限制位 置图之合成性启动子c6-39的序列。 |
