一种基于选择性探针的多重PCR方法及其应用

摘要

本发明涉及核酸扩增，具体涉及一种可同时扩增多个核酸片段的基于选择性探针的多重PCR方法及其应用。本发明所述的多重PCR方法包括以下步骤：(1)构建选择性探针；(2)延伸－连接反应；(3)PCR扩增；(4)检测PCR扩增产物。其关键特征是反应体系中使用了选择性探针，并且，PCR扩增产物可存在长度的差异。该方法不但使分析通量大大提高，还可节省待检样本的核酸模板用量。与传统的使用多对引物的多重PCR技术相比，本发明的方法仅使用一对通用引物，但在理论上可至少同时扩增上千个靶核酸序列，具有操作简便、通量大、检测系统兼容性高等显著优点。

主权项

1、一种基于选择性探针的多重PCR方法，其特征是，包括以下步骤：(1)构建选择性探针：选择性探针的5’-端和3’-端分别设置一个与靶双链核酸序列的同一条核酸单链序列的5’-和3’-端或者靶单链核酸序列的5’-端和3’-端互补的互补区，两个互补区的中间部分设置为两个通用序列区；通用序列区与互补区直接相连，或者通过标签序列相连接；两个通用序列区直接相连，或者中间设置一个尿嘧啶区，通过尿嘧啶区的尿嘧啶寡核苷酸相连；(2)延伸-连接反应：将下列物质混合，进行延伸-连接反应：①起始核酸模板；②步骤(1)所构建的选择性探针；③四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP；④DNA连接酶和DNA聚合酶，及其相应的缓冲液体系；或者，逆转录酶和DNA聚合酶，及其相应的缓冲液体系；(3)PCR扩增：其中反应物包括：延伸-连接反应产物、与选择性探针的通用序列对应的一对通用引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、DNA聚合酶及其相应的缓冲液体系；所述的一对通用引物，其中，一条通用引物与选择性探针的一个通用序列区的序列相同，另一条通用引物则与选择性探针另一个通用序列区的序列互补；(4)检测PCR扩增产物，以确定待检样本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的拷贝数。