人γ－干扰素在毕赤酵母菌中的高效表达、发酵和纯化

摘要

设计并人工合成了特别适合于毕赤酵母菌(Pichia pastoris)中表达的人γ-干扰素的基因序列，构建了胞内表达人γ-干扰素蛋白的载体pPIC3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的毕赤酵母SMD1163为宿主菌，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达克隆株Pichia pastoris SMD1163(Ppic3.5K-ifn，his4 pep4 Δprb1)-181。该菌在28-30℃不含甲醇的培养基培养48小时，再在含1％的甲醇的诱导培养基培养36-48小时，γ-干扰素表达量可达菌体总蛋白的25％。每升含γ-干扰素初品约为1克左右。经DEAE-Sepharose凝胶吸附，Sephacry S-200分子筛层析，DEAE-Sepharose阴离子交换层析，CM-Sepharose阳离子交换层析，得纯度为97.5％以上(HPLC)的人γ-干扰素蛋白。

主权项

1、一种由基因工程菌发酵制备人γ-干扰素的方法，其特征在于，基因结构如下的人γ-干扰素基因序列，ATGCAAGACCCATACGTCAAGGAGGCAGAAAACTTGAAGAAATATTTTAACGCTGGTCATMQDPYVKEAENLKKYFNAGHTCTGACGTGGCAGACAATGGAACATTATTTTTGGGTATTTTGAAGAAGTGGAAAGAAGAGSDVADNGTLFLGILKNWKEETCAGATAGAAAGATTATGCAATCCCAGATCGTCTCCTTCTACTTCAAGCTTTTCAAGAACSDRKIMQSQIVSFYFKLFKNTTCAAAGATGATCAATCCATCCAAAAATCCGTTGAGACAATCAAAGAGGATATGAATGTCFKDDQSIQKSVETIKEDMNVAAGTTCTTTAACTCTAATAAGAAGAAGCGTGATGACTTTGAGAAGTTGACCAATTACTCAKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSGTTACAGACTTGAATGTCCAACGTAAGGCAATCCACGAGCTGATTCAAGTGATGGCAGAAVTDLNVQRKAIHELIQVMAECTTTCTCCAGCTGCTAAAACCGGAAAGAGAAAGAGGTCTCAAATGTTGTTTAGAGGAAGALsPAAKTGKRKRAQMLFRGRCGTGCTTCTCAATAGRASQTerm克隆插入带有甲醇调节型启动子AOX1的载体pPIC3.5K中，获得表达载体pPIC3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的毕赤酵母SMD1163为宿主，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达毕赤酵母株(PichiaPastoris)SMD1163(pPIC3.5K-ifn，his4pep4Δprbl)-181CGMCCNO.0758，经发酵，纯化得人γ-干扰素。