一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法

摘要

一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法，它是以其胸鳍和腹鳍组织为材料，先将鳍组织剪碎，采用胰蛋白酶和透明质酸酶、II型胶原酶分步消化法获得游离鳍细胞和疏松组织块，在含20％胎牛血清、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、人表皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子和牙鲆鳃细胞培养液的L-15培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养。该发明工艺科学合理，经这种方法所获得的传代细胞目前已传至第62代。本发明的大菱鲆鳍细胞未经任何病毒或癌基因转染，可望直接应用于相关理论研究和病毒疫苗的研制。

主权项

1、一种大菱鲆鳍细胞系的构建方法，首先将活大菱鲆在加入了浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的消毒海水中暂养24小时，取出大菱鲆置70％酒精中浸泡1～2分钟后，于超净工作台内无菌剪下背鳍和腹鳍，经70％酒精浸泡30～60秒后，用L-15培养液清洗后放入消毒小烧杯中，添加5毫升含5％胎牛血清的L-15培养液，用眼科剪将鳍组织剪成碎块装入已消毒离心管中，离心收集沉淀物，用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升0.5％胰蛋白酶，混匀后酶解20～30分钟。将胰蛋白酶酶解物装入已消毒的离心管中，离心收集沉淀物，用2毫升L-15培养液悬浮均匀，加入2毫升1.5％透明质酸酶和2毫升0.6％II型胶原酶，混匀酶解1～2小时后装入已消毒的离心管中，离心收集游离鳍细胞和疏松组织块沉淀物，用2毫升大菱鲆鳍细胞专用增殖培养液，分装至2个25毫升培养瓶中，正置干贴6小时后，每瓶补加4毫升鳍细胞专用增殖培养液，置20～22℃生化培养箱中培养，每隔3～5天半量更换大菱鲆鳍细胞增殖培养液一次，所述的专用增殖培养液配方为L-15培养液，以及20％胎牛血清，0.1‰羧甲基壳多糖，0.1‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.1‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.015‰的人表皮细胞生长因子、0.015‰的人碱性成纤维细胞生长因子和20％的牙鲆鳃细胞的培养上清液。