水稻锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用

摘要

本发明公开了首个水稻C2H2型锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用方法。OsZFP18的cDNA序列SEQ ID NO.1及编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明基因为水稻中首次报道的C2H2型锌指蛋白基因。OsZFP18参与水稻的穗发育以及盐胁迫应答，mRNA表达分析表明该基因受高盐的诱导。转基因实验证明该基因的超量表达提高了水稻的耐盐性。OsZFP18可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性。

主权项

1、水稻锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用，包括：1)总RNA的提取选用水稻品种“韭菜青”，待水稻幼苗长至3叶期后，用140mM NaCl进行处理，12小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量；2)水稻锌指蛋白基因OsZFP18的克隆根据水稻锌指蛋白基因OsZFP18的全长编码序列，设计两端引物：上游引物：GCTCGTCATTAAGAGCGAAAG，下游引物：GAATCAACCACAACCGAC CA以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，56℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃ 10min，将PCR产物进行克隆、测序后获得具有完整编码区的水稻锌指蛋白基因OsZFP18的cDNA序列；3)植物表达载体的构建根据水稻锌指蛋白基因OsZFP18的cDNA序列，见SEQ ID NO.1的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsZFP18的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体pCAMBIA1301；4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入水稻，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T2代和对照植株进行180mM NaCl的持续处理，观察他们的生长表现，在耐盐处理3天后的表现明显优于对照组的转基因水稻植株即为获得的耐盐转基因植株。