利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法

摘要

本发明公开了一种利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，由(1)菌种选择，(2)孢子悬液的制备，(3)液体发酵培养，(4)发酵液粗提，(5)铁载体精制等步骤组成。本发明所述方法简单，培养基原料廉价、易于制备，并且采用液体培养技术，利于放大和实现工业化生产，合成的铁载体活性高，性质稳定，具有良好的应用价值。

主权项

1.一种利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，由下述步骤组成：(1)菌种选择：选用黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275，黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC 10864，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 20611，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 1067之一；(2)孢子悬液的制备：将上述黑曲霉接种于麸皮汁固体培养基斜面上，于25℃-30℃温箱培养4-5天，待长出大量孢子后，用生理盐水洗下孢子并收集，将孢子滤液用生理盐水稀释，调节孢子浓度为107-108个/mL，置于无菌试管中，4℃保存备用；其中：所述麸皮汁固体培养基配制方法是：麸皮汁加2％琼脂，121℃灭菌20min，备用；麸皮汁配制方法是：称取100g麸皮加蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，用蒸馏水稀释至1L；(3)液体发酵培养：将上述黑曲霉孢子悬液以体积百分比为1％-2％的接种量，接种于麸皮汁液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基中，25℃-30℃，170-200rpm振荡培养，6-8天后，用四层纱布过滤培养物，收集发酵液，弃去菌体，所获得的发酵液含高活性的铁载体；其中：所述麸皮汁液体培养基配制方法是：麸皮汁用自来水稀释5倍，121℃灭菌20min，备用；所述马铃薯葡萄糖液体培养基配制方法是：马铃薯去皮，称取200g，切成小块，加入蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，用蒸馏水稀释至1L，121℃灭菌20min，备用；(4)发酵液粗提：将上述发酵液滤用截流分子量为1KDa的超滤膜进行超滤，然后超滤液进行真空冷冻干燥，冻干后得到的干粉即为粗提的铁载体粗品；铁载体粗品非常稳定，可长期保存；(5)铁载体精制：将上述铁载体干粉粗品用其体积量5-7倍的水稀释后，加入饱和醋酸铅溶液进行沉淀，至不再产生沉淀为止；然后过滤收集沉淀，并用饱和醋酸铅溶液洗涤沉淀；用超纯水悬浮沉淀，通入现制备的硫化氢，硫化氢与溶液中的铅形成硫化铅沉淀，过滤除去硫化铅沉淀，得除去铅的滤液；滤液用减压旋转蒸发进行浓缩，同时除去滤液中溶解的硫化氢；之后，浓缩液上CM-Sepharose fast flow阳离子交换层析柱，收集含活性组分的透过峰；活性组分再浓缩后上DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析柱，用盐洗脱，收集活性组分分离峰；活性组分经真空冷冻干燥浓缩后，获得精制的铁载体干粉样品。