一种固定化重组高温β－半乳糖苷酶的制备方法

摘要

一种固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法，属于高温β-半乳糖苷酶的固定化及其应用技术领域。本发明以壳聚糖为载体，用三羟甲基膦(THP)为交联剂，选择对高温β-半乳糖苷酶进行固定化处理，采取先用交联剂活化壳聚糖载体，然后再将酶固定在活化好的载体上的固定化顺序获得固定化重组高温β-半乳糖苷酶。以THP作交联剂时，固定化酶制备方便、简捷，酶活回收率可达90％以上，且具有良好的热稳定性和使用稳定性，70℃保温处理5小时，固定化酶活力保留80％以上；以乳糖为水解底物，70℃下使用九个循环后，固定化酶活保留60％以上。

主权项

1.一种固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法，其特征是以壳聚糖为载体，用三羟甲基膦为交联剂，对高温β-半乳糖苷酶进行固定化处理，采取先用交联剂活化壳聚糖载体，然后再将酶固定在活化好的载体上的固定化顺序，所述固定化工艺为：(1)配制壳聚糖凝胶载体：称一定量的壳聚糖，用2％醋酸溶解浸泡过夜，使壳聚糖终浓度为2％，在剧烈搅拌下滴加浓度为6mol/L的NaOH溶液中和，使壳聚糖凝胶析出，以去离子水洗涤，抽干得到处理好的壳聚糖凝胶；(2)载体活化：称取0.32g四羟甲基氯化膦溶液，加入95mL水，在剧烈搅拌下逐滴加入等摩尔的浓度为1.0mol/L的KOH溶液1.68mL，迅速加入12g上述壳聚糖凝胶，缓慢搅动活化5min，抽滤、水洗三次，再抽滤；(3)固定化酶：取一定量β-半乳糖苷酶溶解于pH6.5-7.2、0.05-0.15mol/L的磷酸钠缓冲液至浓度为40-100U/mL，按酶液与壳聚糖v/w为1∶5的比例混合，室温轻微震荡10min，去离子水洗涤，然后用1mol/L的NaCL洗涤三次，抽干得到固定化重组高温β-半乳糖苷酶。