一种快速扩增双链RNA靶序列的方法

摘要

本发明公开了一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，步骤包括：(1)dsRNA的制备；(2)通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化dsRNA；(3)根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计设计获得双链RNA的相应引物；(4)以回收后的dsRNA为模板，添加双链RNA的相应引物，在Taq酶作用下直接进行PCR扩增，获得目的产物。本发明以dsRNA作为模板，充分利用了dsRNA的稳定性；利用TaqDNA聚合酶既有反转录酶活性又有DNA聚合酶活性的特点，省去了反转录过程；实验所需试剂少，操作简单，所用时间短，达到了省时、省钱、省力的效果。

主权项

1、一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，其特征在于它的步骤为：(1)dsRNA的制备：从组织中提取dsRNA；(2)通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化dsRNA；(3)根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计设计获得双链RNA的相应引物；(4)以回收后的dsRNA为模板，添加双链RNA的相应引物，在Taq酶作用下直接进行PCR扩增，获得目的产物；PCR的条件：反应体系：1.5-2.5U的Taq酶，25-100ng/μL的dsRNA模板0.5μL，5-15μM的上游引物0.5-1.5μL，5-15μM的下游引物0.5-1.5μL，10倍Buffer 2-5μL，2.5μM的dNTP 1.6-3.2μL，用ddH2O补足20-50μL；反应条件：采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索；预变性5分钟以后，选择以下几个反应条件中的一个条件：94℃1min、50.2℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；94℃1min、52.6℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；94℃1min、54.9℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；或94℃1min、56.7℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min。