人血管内皮生长因子的多克隆抗体的制备方法

摘要

人血管内皮生长因子的多克隆抗体的制备方法。本发明涉及生物材料领域。本发明是将人血管内皮生长因子基因克隆至原核表达质粒中，并在大肠杆菌中大量表达并纯化，经免疫家兔，以得到特异性好，浓度高的抗体，从而能大量制备出廉价的、高质量的抗人血管内皮生长因子抗体。同时，采用分子克隆技术，将人血管内皮生长因子基因，反向克隆于其核表达载体pcDND3.1中，形成一种可用于疾病抗血管生成治疗的基因制剂。

主权项

1、人血管内皮生长因子的多克隆抗体的制备方法，在于生产抗人血管内皮生长因子多克隆抗体，包括在兔、羊、鼠动物体内制备相应动物来源的抗人血管内皮生长因子多克隆抗体，共步骤：步骤1)、脐静脉内皮细胞培养：按常规方法用0.25％胰蛋白酶消化人脐静脉，获得血管内皮细胞，用含10％胎牛清、5μg％内皮来源和生长因子及100μg肝素M199培养基培养，5天后收获细胞，用Trizol试剂提取RNA；步骤2)、RT-PCR扩增：用Promega公司的试剂盒及5μg总RNA，进行RT-PCR；步骤3)、酶切：将PCR产物经BamHI及EcoRI酶切后连接到pBluescript，pbsSK+中；步骤4)、VEGF165 cDNA序列的测定：将已克隆在克隆载体pBluescript中的VEGF165 cDNA进行测序，测序结果其序列与基因库完全一致；1 atgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccaccat61 gccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtg121gtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggac181atcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgccctg241atgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtcc301aacatcaccatgcagcttatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatg361agcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaa421aatccctgtgggccttgctcagagcggaagaaagcatttgtttgtacaatatccgcagacg481tgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaaggcgaggcagcttgagttaaac541gaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtga步骤5)、感受态细胞的制备及重组质粒的转化：用无菌接种棒从-75℃保存的Dh5a菌株蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂盘，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，细菌培养摇床中37℃、200转/分震荡培养20小时。取0.5ml该菌液接种于含氨苄青霉素5ml LB培养基中300转/分培养至OD6000.4之后在4℃离心机中4000转/分离心10分钟。弃上清，以5ml预冷的无菌0.1M氯化钙重悬沉淀，冰浴30分钟后再次离心，沉淀以2ml氯化钙重悬，4℃放置16小时，分装备用，剩余的加25％甘油储存于-80℃。取5ul DNA连接产物加入200ul感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均匀，冰浴中30分钟，42℃水浴中热休克90秒，再次冰浴2-3分钟后加不含氨苄青霉素的LB培养基600ul于37℃200转/分复苏45分钟后，以200ul菌液铺盘，用LB琼脂培养盘，含氨苄青霉素70ug/ml，，在37℃培养过夜；步骤6)、重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养盘中挑取5个克隆接种于5ml含氨苄青霉素70ug/ml的LB培养基中，剧烈震荡300转/分培养16小时，以miniprep方法小量提取质粒DNA，限制内切酶和消化，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体的阅读框中；步骤7)、选鉴定正确克隆的菌液接种于含氨苄青霉素70ug/ml大量LB培养基中进行质粒的大量扩增，去内毒素质粒大量提取试剂盒提取纯化。