乌饭树黑色素中黄酮类单体的提取、分离、纯化及鉴定

摘要

一种乌饭树树叶黑色素中黄酮类化合物单体的提取、分离、纯化及结构鉴定的方法，属于黄酮类化合物技术领域。本发明以乌饭树树叶为原料，经乙醇提取得到乌饭树树叶黑色素溶液，再经大孔吸附树脂对黑色素中的黄酮类化合物进行粗分离，再通过聚酰胺柱和HW－40柱对黄酮类化合物单体进行纯化，再用高效液相色谱－质谱、核磁共振技术对纯化组分进行结构鉴定；从中分离出7种黄酮类化合物单体，分别为A、B、C、D、E、F和G，并对B、C、D、E和F进行了精确的结构鉴定，确定分别为槲皮素、白杨黄素、芹黄素、山奈酚和木犀草素，其相对含量分别为：37.51％，2.26％，9.57％，1.72％和15.16％。

主权项

1.一种乌饭树树叶黑色素中黄酮类化合物单体的提取、分离、纯化及结构鉴定的方法，其特征是以乌饭树树叶为原料，经乙醇提取得到乌饭树树叶黑色素溶液，再经大孔吸附树脂对黑色素中的黄酮类化合物进行粗分离，再通过聚酰胺柱和HW-40柱对黄酮类化合物单体进行纯化，再用高效液相色谱-质谱、核磁共振技术对纯化组分进行结构鉴定；(1)乌饭树树叶黑色素溶液的提取：将清洗干净、晾干的乌饭树树叶利用组织捣碎机湿法捣碎，加入反应釜，利用酒精溶液进行提取，料液比以质量计为1∶20～1∶30，酒精溶液体积浓度为60％，提取温度为55～60℃，搅拌提取1h，将溶液滤出，回收酒精后得到提取物的水溶液，回收的酒精溶液调节体积浓度为60％后加入至反应釜，按照相同条件对反应釜中的树叶二次提取1h，将溶液滤出，回收酒精后得到提取物的水溶液和第一次提取得到的提取物的水溶液合并，浓缩至提取液的水分含量不超过10％，备用；(2)大孔吸附树脂对黑色素中的黄酮类化合物进行粗分离：提取液常温下加体积比为1∶1的正丁醇萃取半小时，正丁醇萃取液减压浓缩至无醇味，加入以体积计为1∶2～1∶3的去离子水，超声振荡，水溶液上AB-8大孔吸附树脂柱，先用2～3倍柱体积的去离子水洗脱，弃去洗脱液，再用3～5倍柱体积的体积浓度为95％的酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩至酒精含量不超过5％，备用；(3)聚酰胺柱和HW-40柱对黄酮类化合物单体进行纯化：将大孔吸附树脂柱洗脱下来的洗脱浓缩液，上聚酰胺大柱，柱体积φ4cm×50cm，分别用水、体积浓度为20％的酒精、45％酒精、70％酒精、95％酒精依次进行洗脱，每次洗脱液用量为2～3个柱体积，收集洗脱液，在薄板上点样分析，合并相同的组分，相同组分浓缩至水分含量不超过5％，各组分分别上聚酰胺小柱，φ3cm×30cm，以酒精的体积浓度逐次增加5％为一个梯度，进行洗脱，一个梯度洗脱量为一个柱体积，每10mL收集在一个试管中，在薄板上点样分析，合并相同组分；各组分浓缩至水分含量不超过5％，各组分分别上HW-40柱，以酒精的体积浓度逐次增加5％为一个梯度，进行洗脱，采用部分收集器收集，每5mL收集在一个试管中，薄板点样合并相同组分，得到黄酮类化合物单体A、B、C、D、E、F、G；(4)高效液相色谱-质谱、核磁共振技术对纯化组分进行结构鉴定：将得到的黄酮类化合物单体溶解于甲醇中，利用液质连用仪进行分析，液相条件：色谱仪：WATERS 2690；检测器：WATERS 996；分析柱：Lichrospher C-18 2.1×250mm；流动相：甲醇与1％乙酸梯度洗脱，甲醇浓度从0到100％；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；质谱条件：离子方式：EIS-，EIS+；毛细管电压：EIS-为3.88kV，EIS+为3.87kV；锥孔电压：EIS-为30V，EIS+为24V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：300℃；质量范围：200-800m/z；光电倍增器电压：650V；分析柱压：2.6e-5mBar；气体流速：4.2 L/hr；将分离出的黄酮类化合物单体溶解于二甲基亚砜中，在Bruker核磁共振仪上测定1H-NMR，13C-NMR，DEPT-NMR，以四甲基硅烷为内标物。