使用表达人的ENaC的卵母细胞的改进的电生理测定法和用于在使用膜电位报告染料的测定中提高ENaC增强子功效的PHENAMIL的用途

摘要

在一个方面，本发明涉及基于哺乳动物细胞的高通量测定法，所述测定法用于表征和筛选从人肾cDNA文库中克隆的人上皮钠通道(hENaC)，所述hENaC也在其它组织包括人味觉组织中表达。本发明进一步涉及基于两栖动物卵母细胞的中通量ENaC电生理测定法，所述测定法用于鉴定人ENaC调节剂，优选的是ENaC增强剂。在基于细胞的测定法中调节ENaC功能的化合物预期影响人的盐味觉。此处描述的测定法具有优于现存的细胞表达系统的有利方面。在哺乳动物细胞的情况下，这些测定法可在标准的96或384孔培养板上以高通量的模式进行，通过使用抑制ENaC功能的化合物(优选氨氯吡嗪脒染生物，如Phenamil)获得提高的测定结果。在独特的卵母细胞电生理测定法(两电极电压钳技术)的情况下，这些测定法促进对特异性调节人ENaC的化合物的鉴定。本发明的测定法提供了强有力的用于检测促进(增强)或抑制hENaC功能的化合物。因此，增强或阻断人ENaC通道活性的化合物应当调节人的盐味觉。

主权项

1.用于表征和筛选上皮钠通道(ENaC)的假定调节剂的基于哺乳动物细胞的高通量测定方法，其包括：在至少部分地抑制ENaC功能的条件下将受试细胞与至少一个已知的ENaC抑制剂接触，之后在钠或锂存在的情况下将所述受试细胞与至少一种假定的调节剂化合物接触，所述受试细胞表达α、β和γ亚基或δ、β和γ亚基或这三个亚基中各亚基的变体、片段或功能性等同物，并且所述受试细胞预先荷载了膜电位荧光染料或钠荧光染料；和监控在所述假定的调节剂/ENaC相互作用存在的情况下阴离子介导的所述受试细胞的荧光变化，将所述变化与所述调节剂不存在的情况下的变化相比较以确定ENaC调节的程度。