DNA光修复酶的纯化制备方法

摘要

本发明DNA光修复酶的纯化制备方法，特征是先利用基因工程方法获得带有组氨酸-标签的大肠杆菌DNA光修复酶，经镍离子亲和层析柱亲和层析，可一步纯化制备得到近90％纯度的DNA光修复酶，克服了现有纯化方法步骤繁杂、周期长、后处理麻烦、纯化过程中蛋白质易丢失或时间长引起蛋白质变性的缺陷；采用的镍离子亲和层析柱基质价格相对便宜，分离效果好，适用于DNA光修复酶产业化制备。本发明提出的采用高效液相色谱法检测DNA光修复酶的活性，可克服现有活性检测方法对酶底物要求高、步骤繁杂、实验操作难、环境污染的缺陷。本发明为预防和治疗紫外线对人体的伤害开辟了新的途径，并为紫外线防护产业展示了新的前景。

主权项

1、一种DNA光修复酶的纯化制备方法，包括设计扩增DNA光修复酶基因的引物、构建克隆、菌液培养、蛋白诱导表达、蛋白的亲和层析纯化以及酶活性检测；其特征在于：以含有DNA光修复酶基因的生物体的基因组DNA作为模板，设计用于扩增DNA光修复酶基因的两端引物，运用DNA聚合酶链式反应将DNA光修复酶基因进行体外扩增，并构建到带有组氨酸-标签的载体质粒中；在含所述质粒的表达菌株中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达2-10个小时，收集菌液，将菌液于4000个重力加速度条件下离心沉淀菌体，用溶菌缓冲液重悬菌体后得到的重悬液于1.4×108帕斯卡高压破碎菌体，破碎后的菌体液在15000-30000个重力加速度条件下冷冻离心去除菌体碎片；将离心分离出的上清液加入已结合镍离子并用含0.005-0.05mol/l咪唑的缓冲液平衡过的镍离子亲和层析柱内，使DNA光修复酶充分结合后，用含0.005-0.05mol/l咪唑的缓冲液洗去不能结合或非特异性结合的杂蛋白，再用含0.5-1.0mol/l咪唑的缓冲液或者镍离子螯合剂洗脱，收集洗脱样品，透析，冷冻干燥；然后对所得到的DNA光修复酶进行活性检测。