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1、一种海绵共附生优势细菌组成及宿主特异菌的分子鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1)海绵共附生微生物的基因组总DNA的提取：将海绵样品用无菌小刀切成小块，加入pH8.0-8.5的由三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸二纳配置的TE缓冲液，于置于冰块上的研钵中研磨，取研磨后的悬浮液离心弃上清，加入TE缓冲液悬浮沉淀，并加入溶菌酶混匀，35-40℃水浴处理，再加入十二烷基磺酸纳及蛋白酶K混匀于50-60℃水浴处理，离心取上清，加入1-1.5倍体积的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚充分混匀重复抽提，离心取上清，依次加入1-1.5倍体积的体积比为25∶24∶1的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚∶氯仿∶异戊醇混合液、1-1.5倍体积的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液处理，离心取上清后，加入0.1-0.2倍体积的5M NaCl和1-2倍体积的异丙醇处理析出DNA沉淀，离心弃去异丙醇，加入70-75％的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙醇，干燥后将沉淀加入TE缓冲液和不含DNA酶的RNase酶，35-40℃水浴处理消解去除RNA，琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组总DNA样品；2)16S rDNA-DGGE基因指纹图的构建：以第1步得到的基因组总DNA样品为模板，采用针对细菌16S rDNA的通用引物经聚合酶链式反应扩增得到海绵共附生细菌DNA的16S rDNA片段，将小于500bp的16S rDNA的混合片段进行变性梯度凝胶电泳，染色、拍照得到变性梯度凝胶电泳的指纹图谱；3)海绵共附生的优势细菌组成的分子鉴定：对于每一种海绵的变性梯度凝胶电泳的指纹图谱，割胶回收条带，经无菌水多次冲洗后捣碎，加入TE缓冲液浸泡、涡旋后离心取上清作为聚合酶链式反应的模板进行再扩增，确认是回收的条带后用DNA纯化试剂盒纯化，构建重组载体后转化宿主菌，筛选、鉴定连接有外源DNA片段的阳性克隆，提取质粒DNA进行16S rDNA测序，通过对照基因库进行序列同源性比对和系统发育树分析，确定条带代表的细菌的分类地位；4)海绵宿主特异菌的分子鉴定：通过对比不同海绵的变性梯度凝胶电泳指纹图谱的差异，找出某一海绵特有的差异性条带，采用以上相同的方法割胶回收、克隆测序、序列同源性比对和系统发育树分析，确定宿主特异菌的分类地位。 |
