通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法

摘要

发明提供一种通过设计的特定引物来完成PCR反应，放大感染HIV病毒的患者的T细胞受体TCR基因在接受药物治疗前后的变化，进而评价药物的疗效的方法，本发明提供的技术不但填补了技术上的空白而且具有灵敏度高，准确性好的优点。

主权项

1.通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法，其步骤为：a.血样经采集分离后，得到外周血单个核细胞，再进一步分离出CD4或CD8T细胞；b.分离和提纯出T细胞的mRNA后，通过mRNA合成得到cDNA；c.在极其靠近CDR3区段V基因区设计22个内侧Vβ基因引物和一个内侧Cβ基因引物，Cβ基因引物的5′端插入七个非模板碱基GTTTCTT，Cβ基因引物采用高灵敏度的荧光标记，所述Vβ基因引物和Cβ基因引物如下：Vβout PCR引物：Vβ1out 5′GGA GTC ACA CAA ACC CCA AAG CAC CTG 3′，Vβ2out 5′GTT ATC TGT AAG AGT GGA ACC 3′，Vβ3out 5′CTC GTA GAT GTG AAA GTA ACC CAG AG 3′，Vβ4out 5′GAT AGC CAA GTC ACC ATG ATG TTC 3′，Vβ5.1out 5′GTC GAT TCT CAG GGC GCC AGT TCT C 3′，Vβ6out 5′GAG TCT CCC AGA ACC CCA GAC ACA AG 3′，Vβ7out 5′GGT CAT GGG AAT GAC AAA TAA GAA G 3′，Vβ8out 5′CGA TAG ATG ATT CAG GGA TGC CCG AG 3′，Vβ9out 5′GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA C 3′，Vβ11out 5′CTG ACA TCT ACC AGA CCC CAA GAT AC 3′，Vβ12out 5′GAT ACT GAC AAA GGA GAA GTC 3′，Vβ13out 5′CAA GAC CCA GGC ATG GGG CTG AAG 3′，Vβ14out 5′GGG AGA TGT TCC TGA AGG GTA C 3′，Vβ15out 5′CTC GAC AGG CAC AGG CTA AAT TC 3′，Vβ16out 5′GAT TCT TAG CTG AAA GGA CTG GAG G 3′，Vβ17out 5′GAA GGG TAC AGC GTC TCT CGG GAG AAG 3′，Vβ18out 5′GCC GGC GTC ATG CAG AAC CCA AGA C3′，Vβ20out 5′CTC TCA GCC TCC AGA CCC CAG3′，Vβ21out 5′GCC TGT GGC TTT TTG GTG CAA TC 3′，Vβ22out 5′CAC ACA GAT GGG ACA GGA AG 3′，Vβ23out 5′CCC TGA TCG ATT CTC AGC TCA AC 3′，Vβ24out 5′CGG CCG AAC ACT TCT TTC TG 3′；Vβin PCR引物：Vβ1in 5′CTA AAC CTG AGC TCT CTG G 3′，Vβ2in 5′GCA GCT TCT ACA TCT GCA G 3′，Vβ3in 5′GAT TCT GGA GTC CGC CAG 3′，Vβ4in 5′CAG CAG CAT ATA TCT CTG C 3′，Vβ5.1in 5′GAC TCG GCC CTT TAT CTT TG 3′，Vβ6in 5′GGA GAT CCA GCG CAC AGA G 3′，Vβ7in 5′CCT GAA TGC CCC AAC AGC TC 3′，Vβ8in 5′CCA GCC CTC AGA ACC CAG G 3′，Vβ9in 5′CTG GAG CTT GGT GAC TCT GTG 3′，Vβ11in 5′CCT GGA GTC TGC CAG GCC 3′，Vβ12in 5′CTC ACT CTG GAG TCG CTA C 3′，Vβ13in 5′GAG GAT TTC CCG CTC AGG C 3′，Vβ14in 5′GAG AAG AGG AAT TTC AAT TTC C 3′，Vβ15in 5′GAG TCT GCC ATC CCC AAC 3′，Vβ16in 5′CAG AAC TGG AGG ATT CTG G 3′，Vβ17in 5′CGG CCC AAA AGA ACC CGA CAG C 3′，Vβ18in 5′GTG CGA GGA GAT TCG GCA G 3′，Vβ20in 5′CAG GAC CGG CAG TTC ATC TTC 3′，Vβ21in 5′CCT GCA GAG CTT GGG GAC 3′，Vβ22in 5′CAC TCT GAA GAT CCG GTC C 3′，Vβ23in 5′GAG CTC CTT GGA GCT GGG G 3′，Vβ24in 5′CAT CCG CTC ACC AGG CCT GGG 3′；Cβout 5′CAG GCC TCG GCG CTG ACG ATC TGG GTG AC 3′，3′Cβin*5′GTT TCT TG ATC TCT GCT TCT GAT GGC TCA AAC 3′，*6-FAM labelling；d.将设计的引物和由mRNA合成的cDNA通过两次PCR反应来扩增cDNA，所述两次PCR反应的条件为：第一次反应：变性95℃，45秒；复性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34个循环，72℃10分钟；反应体系为：5′引物10pmol 1μl，3′引物10pmol 1μl，dNTPs 10mM 1μl，10×反应缓冲液 2.5μl，三蒸水 18.75μl，cDNA 0.5μl，Taq DNA聚合酶 0.25μl；第二次反应：变性95℃，30秒；复性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15个循环，72℃10分钟；反应体系为：5′引物10pmol 0.5μl，3′引物10pmol 0.5μl，dNTPs 10mM 1μl，10×反应缓冲液 2.5μl，三蒸水 19.75μl，第一次PCR产物 0.5μl，Taq DNA聚合酶 0.25μl；其中10×反应缓冲液的组分如下：Tris-HCl pH8.3 300mM，MgCl2 50mM，KCl 25mM，明胶 0.01％；e.将经过两次PCR反应扩增并被荧光标记的T细胞受体基因，与甲酰胺混合后94℃变性，将变性产物置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行，得到的数据用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析和量化，通过比较HIV病毒感染者治疗前后CDR3基因图谱的变化，得出药物疗效的评价结果。