一种可生产植酸之乳酸菌及其表现载体

摘要

本发明系一种藉由基因重组技术，将插有cgt基因之 PHY300PLK载体之重组质体pHG予以改造，继而以cgt基因当作报导基因(reporter gene)，利用限制部分剪切方式进行抗生素抗性标识(selective marker)基因的不活化，所得之重组质体命名为pHGa-t-，以建立具食品安全性的表现系统。并选殖植酸基因于此表现载体上，再转形至肠内益菌--Lactobacillus casei(ATCC 27092)中，使其具有代谢植酸的能力。其首先系将重组质体pHG进行电转形条件最适化的探讨，结果发现两种弱化细胞壁的方法，皆能有效提高转形效率，而转形株--Lb. casei(pHG)可稳定地将CGTase分泌至胞外。

主权项

1.一种制备可生产植酸之乳酸菌之方法,其包含 如下步骤: (1)、自枯草杆菌B. subti1is DB2抽取染色体DNA; (2)、以聚合链锁反应(PCR)选殖出编码植酸之 基因片段; (3)、将具有抗生素抗性标识基因不活化之特性之 安全性重组载体pHGa-t-与步骤二中PCR所得之植酸 之基因(phc基因)分别以内切限制剪切; (4)、回收步骤3中所制得经内切限制剪切之DNA片 段,并将该两DNA片段接合,如此即得一重组质体PHGP; (5)、将该重组质体PHGP依电转形方式送入乳酸菌进 行转形作用; (6)、所得含该重组质体PHGP之乳酸菌转形株即为具 有可生产植酸之乳酸菌。 2.依据申请专利范围第1项中所述之方法,其中步骤 3中之所使用之内切限制为DrdI、SacI。 3.依据申请专利范围第1项中所述之方法,其中可以 甘胺酸(Glycine)弱化细胞壁。 4.依据申请专利范围第1项中所述之方法,其中可以 溶菌Lysozyme弱化细胞壁。 5.依据申请专利范围第1项中所述之方法,其中可以 以环状糊精葡萄糖单基转移(cyclodextrin glucand transferase, cgt)为其报导基因。 6.依据申请专利范围第1项中所述之方法,其中可以 利用具植酸之特性为其报导基因。 7.一种重组载体pHGa-t-其系具有抗生素抗性标识基 因不活化之特性,以避免影响抗生素对于人体之效 用,建立具食品安全性的表现系统。 8.一种制备如申请专利范围第7项所述重组载体pHGa -t-之方法,其包含如下步骤: a、将pHG上之tetracycline resistance gene以限制剪切; b、回收于步骤a中不含tetracycline resistance gene之DNA 片段; c、DNA份子补齐; d、DNA接合; e、以电转形进行转形作用; f、形成具有重组质体之转形株pHGt-; g、将该转形株pHGt-质体以限制剪切ampici11in resistance gene; h、回收步骤g中不含ampicillin resistance gene之DNA片段 ; i、DNA接合; j、电转形至E.coli DH10B; k、自所形成转形株回收得重组载体pHGa-t- 9.依据申请专利范围第8项中所述之方法,其于步骤 a中限制为ScaI、EcoRV。 10.依据申请专利范围第8项中所述之方法,其于步 骤g中使用之限制为Bg1I、PstI。 图式简单说明: 图一:系植酸之结构。 图二:系植酸对植酸之脱磷作用。 图三:系安全性表现载体构筑。 图四:系pHG与pHGt-以限制剪切之电泳图。 图五:系pHG与PHGa-t-以限制剪切之电泳图。 图六:系含pHG、pHGt-及Phy300plk质体之E. coli限选殖株 培养在LB、LST及LSA固体培养基,经碘染色结果。 图七:系以SDS-PAGE(A)及西方墨渍法(B)分析CGTase基因 在E. coli细胞中之表现。 图八:系pHG与pHGat-质体DNA之稳性。 图九:系枯草杆菌植酸序列之比对。 图十:系B. subti1isDB2疑植酸基因的聚合链锁反 应产物之电泳图。 图十一:系pHGP质体之构筑。 图十二:系pHGP质体以限制剪切之电泳图。 图十三:系植酸之核酸及其胺基酸序列。 图十四:系不同枯草杆菌株之植酸序列比对。 图十五:系不同来源植酸之演化关系分析结果。 图十六:系pHG以限制切之电泳图。 图十七:系含pHG质体之Lb.casei培养在MRSS/Tc固体培养 基,经碘染色之结果。 图十八:系西方墨渍法分析cgt基因在Lb. casei细胞中 之表现。 图十九:系以聚合链锁反应进行重组质体正确性 之分析。 图二十:系植酸基因在Lb. casei(pHGP)中之表现。