METODO PARA PREPARAR UNA CEPA DE BRUCELLA ATENUADA QUE CARECE DEL GEN RESPONSABLE DE LA SINTESIS DE LA ENZIMA FOSFOGLUCOMUTASA, METODO PARA PREPARAR EL PLASMIDO PSG75 EMPLEADO EN DICHO METODO, PLASMIDO OBTENIDO POR ESTE ULTIMO, CEPA DE BRUCELLA ATENUADA OBTENIDA MEDIANTE EL PRIMER METODO, COMPOSICIO

摘要

Un método para preparar una cepa de Brucella atenuada, especialmente de B. abortus, que carece del gen responsable de la síntesis de la enzima fosfoglucomutasa (código E.C. 2.7.5.1 del Comité Internacional de nomenclatura de las enzimas), en donde dicha cepa, entre otros defectos, carece del antígeno-O del lipopolisacárido (LPS), que comprende los siguientes pasos: A) preparar el plásmido pSG75 que contiene la construcción genética dicistrónica SacB-Gm; B) preparar un plásmido pUB22, que contiene al gen pgm de Brucella ssp.; C) preparar el plásmido pUB22::S-G que contiene el gen pgm de Brucella ssp. interrumpido con el dicistrón SacB-Gm; D) introducir el plásmido pUB22::S-G en una cepa patógena de Brucella por electroporación; E) seleccionar una cepa de Brucella intermediaria que contiene el gen pgm interrumpido por el cassette discistrónico SacB-Gm; F) obtener el plásmido pKB43deltapgm que contiene una deleción del orden de 60% del gen pgm e introducirlo en la cepa de E. coli S17.1lambdapir; G) seleccionar una cepa Brucella spp. deltapgm conteniendo una deleción del orden de 60% del gen pgm; y H) verificar que la cepa de Brucella spp- deltapgm generada carece de actividad fosfoglucomutasa y de otras propiedades derivadas que dependen de la misma. La obtención de estas cepas se logra mediante una mutación por deleción del gen pgm que codifica para la proteína fosfoglucomutasa, enzima clave en el metabolismo de los azúcares bacterianos, cuya falta impide la producción endógena de glucosa-1-fosfato que es el intermediario en una serie de reacciones anabólicas que conducen a la síntesis del LPS y glucano cíclico, dos productos que participan en la virulencia de Brucella y que estan ausentes en estas mutantes, lo que explica su avirulencia. Método para preparar un plásmido que comprende al dicistrónico SacB-Gm empleado en el paso (A) del método descripto, siendo dicho plásmido el identificado como pSG75, y plásmido obtenido. Cepas de Brucella que carecen del antígeno-O del lipopolisacárido (LPS) característico de las cepas rugosas, debido a su incapacidad para sintetizar el core completo. Estas cepas presentan capacidad protectora siendo de utilidad para la preparación de vacunas más efectivas que las conocidas hasta el presente. Vacuna contra Brucella que comprende una cepa mutante que carece del antígeno-O del lipopolisacárido (LPS), en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta es una vacuna de una cepa rugosa, atenuada, y que brinda protección contra las cepas salvajes de Brucella, especialmente contra Brucella abortus. Uso de una cepa mutante que carece del antígeno-O del lipopolisacárido (LPS) para preparar una vacuna contra la brucelosis de aplicación en mamíferos, incluyendo al hombre, que brinda protección contra las cepas salvajes de Brucella, en forma particular contra Brucella abortus. Las inoculaciones experimentales en animales demostraron que la cepa es eliminada rápidamente del animal y es capaz de generar una inmunidad protectora al desafio con la cepa patógena, lo que la constituye en una excelente vacuna para el control de la brucelosis, especialmente la bovina.