腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法

摘要

本发明属于一种酶抑制剂的筛选模型。腺苷同型半胱氨酸水解酶是一个抗炎、抗病毒、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病的重要靶酶。调节酶的活性能治疗相关疾病，本发明旨在寻找合适的抑制剂，以求发现有价值的新药，应用腺苷同型半胱氨酸水解酶和活化的琼脂糖凝胶为基本原料，通过偶联方法，得到固定化酶，添加氧化型辅酶I(NAD⁺)，以保证酶的活性。该酶抑制剂的高通量筛选，特别适用于对有色化合物和复杂成分如中药和天然提取物的筛选。固定化酶的活性比未固定的腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性略降低，但较普通的酶稳定，可重复利用。

主权项

1.一种腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法，其特征在于分以下步骤完成：一、模型建立过程：固定腺苷同型半胱氨酸水解酶反应在0-10℃进行，所用试剂在0-10℃预冷；1)偶联：取活化载体，离心，弃上清，用1mmol·L-1盐酸和pH＝7.4磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液各洗涤3-5次，加入一定量的腺苷同型半胱氨酸水解酶，混匀，50-200rpm振荡4-8小时，反应完毕后，离心，上清与封闭步骤中所得到的洗涤液合并，用于测定蛋白浓度，固定化酶的蛋白浓度＝加入的蛋白总浓度-上清中的蛋白浓度；2)封闭：得到的沉淀用10-100mmol·L-1 pH7.0-7.4的Tris-HCl缓冲液封闭过夜，离心，用10-100mmol·L-1 pH8.0-8.5的Tris-HCl-NaCl和1-10mmol·L-1 pH4-5的HAc-NaAc两种缓冲溶液轮流洗涤3-5次，得洗涤液；3)活化：加入含有辅酶的磷酸缓冲液进行活化，室温放置1小时，再用pH7.0-7.4的10mmol·L-1磷酸缓冲液洗涤至上清280、340nm吸收值稳定；二、抑制剂筛选待筛选药物与固定化酶反应，测定腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性判定该物质是否该酶的抑制剂；取500μL-1mLpH7.0-7.4的磷酸缓冲液中含不同浓度淫羊藿提取物及4μg酶蛋白的固定化酶，30-40℃温育30min，加Ado、Hcy至终浓度1mmol·L-1、4mmol·L-1，30-40℃水浴5-10min，5mol·L-1 H2SO4中止反应，离心，HPLC检测上清液中腺苷同型半胱氨酸的含量，根据其含量变化反映样品对腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的抑制程度，抑制率超过50％者可以确定为腺苷同型半胱氨酸水解酶的抑制剂。