| 主权项 |
1.一种改良可表现天冬胺酸异构化之抗-IgE抗体之 方法,包括: a)于未改良之抗-IgE抗体或抗体片段确认有同分异 构化作用倾向的天冬胺醯基残基; b)藉由噬菌体表现(AMPD)的亲和力突变取代任选的 残基以制造候选分子,并就对抗IgE之亲和力来筛选 所得之候选分子;及 c)选择表现相当或相较于未改良抗-IgE抗体具较高 亲和力之候选分子。 2.根据申请专利范围第1项之方法,其中未改良抗体 系为包含由SEQ ID NOs 13及14所组成之轻链及重链序 列之E25抗体。 3.一种改良抗-IgE抗体,其系由申请专利范围第1或2 项之方法所制得,其特征在于(1)于经取代残基上不 表现天冬胺醯基异构化;(2)相对于未改良抗体,其 对于IgE具有相当或更大之亲和性及(3)阻断致敏性 RBL48细胞释出组织胺。 4.一种抗体,其系由申请专利范围第2项之方法所制 得,其中取代残基为可变轻链CDR1残基Asp32Glu,Gln27Lys 和Ser28Pro,其特征在于(1)于经取代残基上不表现天 冬胺醯基异构化;(2)相对于未改良抗体,其对于IgE 具有相当或更大之亲和性及(3)阻断致敏性RBL48细 胞释出组织胺。 5.根据申请专利范围第4项之抗体,其中额外取代之 残基为可变重链CDR2残基Thr53Lys,Asp55Ser,Ser57Glu和Asn 58Lys。 6.一种抗体分子,其系包括分别由SEQ ID NOs15及16所 定义之可变重链及轻链序列。 7.一种抗体分子,其包括一抗体片段,其系由选自F( ab)(SEQ ID NOs:19及20),sFv(SEQ ID NO:22)及F(ab')2(SEQ ID NOs: 24及25)之序列所定义。 8.根据申请专利范围第6或7项之抗体分子,其系与 药学上可接受之赋形剂混合以用于减少或预防哺 乳动物中经由IgE-调节所产生的组织胺。 9.一种抗体分子,其系包括分别由SEQ IN NOs17及18所 定义之可变重链及轻链序列。 10.一种抗体分子,其包括一抗体片段,其系由选自F( ab)(SEQ IN NOs:19及21);sFv(SEQ ID NO:23)及F(ab')2(SEQ ID NOs: 24及26)之序列所定义。 11.根据申请专利范围第9或10项之抗体分子,其系与 药学上可接受之赋形剂混合以用于减少或预防哺 乳动物中经由IgE-调节所产生的组织胺。 12.一种核酸分子,其编码如申请专利范围第1、6、7 、9或10项之抗体。 13.一种用于降低或预防哺乳动物中IgE调节组胺酸 产生之组合物,其包括至少一种医疗有效量之E26抗 体,该E26抗体包括分别由SEQ ID NOs:15及16所定义之E26 重链及轻链之序列。 14.一种用于降低或预防哺乳动物中IgE调节组胺酸 产生之组合物,其包括至少一种医疗有效量之E26抗 体,该E26抗体包括一序列,系选自F(ab)[SEQ IN NOs:19-20] 、sFv[SEQ ID NO:22]和F(ab)'2[SEQ ID NOs:24-25]所组之群。 15.一种用于降低或预防哺乳动物中IgE调节组胺酸 产生之组合物,其包括至少一种医疗有效量之E27抗 体,该E27抗体包括分别由SEQ ID Nos 17及18所定义之E27 重链及轻链之序列。 16.一种用于降低或预防哺乳动物中IgE调节组胺酸 产生之组合物,其包括至少一种医疗有效量之E27抗 体,该E27抗体包括一序列,系选自F(ab)[SEQ ID NOs:19 & 21]、sFv[SEQ ID NO:23]和F(ab)'2[SEQ ID NOs:24 & 26]之组成 之群。 17.一种用于降低或预防哺乳动物中IgE调节组胺酸 产生之组合物,其包括由SEQ ID NOs:17及18所定义之E27 重链及轻链之序列。 18.一种用于降低或预防哺乳动物中IgE调节组胺酸 产生之组合物,其包括抗体片段,其系选自F(ab)[SEQ IN NOS:19及21]、sFv[SEQ ID NO:23号]和F(ab)'2[SEQ ID NOs:24 及26]所组之群。 图式简单说明: 图1系比较在老鼠抗体MAE11、人类一致序列之重链 亚组III(humIII)和轻链亚型I(humI)和片段F(ab)-2, 带有CDR残基和某些骨架残基修改成老鼠之经过修 改的人类抗体片段之间的VH和VL功能部位。 图2为比较在rhuMabE25、E426和序列E26与E27之间之轻 链和重链CDR功能部位之间的序列差异。在这里残 基的编号是连续的,与Kabat等人的那些是相对的。 亦注意到这些序列只是片段,并不是确实的全长之 重链与轻链残基。 图3为以FACS为基础之试验的图表,表示受试抗体抑 制FITC-共轭之IgE与在CHO 3D10细胞上表现之高亲和力 FcRI受体的-链结合的能力。表示受到老鼠mAb MaE11( ),阴性对照之人类化的mAb4D5( ),F(ab)-2( ○),F(ab)-9(●),F(ab)-11(),以及F(ab)-12(▲)的抑制百 分比。数据点为三个实验的平均値,除了mAb 4D5之 外,它是单一的实验値。结果显示MaE11和受试之F(ab )群阻断了FITC-IgE与CHO 3D10细胞表现之FcRI的-链 的结合。 图4为以FACS为基础之试验的图表,测量受试抗体与 装载在CHO 3D10细胞上表现之高亲和力受体FcRI之 -亚单元的IgE的结合作用。表示受到老鼠mAb MaE11 (○),人类突变种12(▲),阳性对照的老鼠mAb MaE1(●), 阳性对照抗体老鼠MOPC21(),以及阴性对照之人类 化的mAb 4D5( )的抑制百分比。在算术/线性的规 模上,0.1微克/毫升的平均渠道萤光値为MPOC21 7.3,MaE 1 32.1,MaE11 6.4,hu4D5 4.7和huMaE11 4.6。三个老鼠mAbs全 部都是老鼠同型物IgG1,而两个人类化的mAbs都是人 类同型物IgG1。数据点为三个实验的平均値。结果 显示MaE11和F(ab)-12不与装载CHO 3D10细胞表现之FcRI -链的IgE结合。 图5为抗-IgE之莫耳比例对猪草(ragweed)诱发之组织 胺释放的抑制百分比的图表。显示E-25(●)和E-26( ○)。结果显示F(ab)形式的E26,以剂量依赖之方式, 有优异的猪草-诱发之组织胺释放的抑制作用,具 有44:1的半-最大抑制莫耳比例(抗-igE:RSIgE)。 图6为在实例4第II部份中描述的各圈亲和力选择作 用之后,亲和力增强作用的图表说明。展示每个池 与野外型(Emut/Ewt)之结合增强作用的比例。结果显 示VL库(以"a"&"b"表示)成功地展示出改良的相对性 增强作用,在5-6圈的增强作用之后,比野外型高大 约10倍。此外,VH库("c"&"d")在大约3圈后,显示出大约 3倍的改良。注意到"a"相当于在VL CDR-1残基27、28、 30和31处突变的Fab-噬菌体库,而"b"相当于在30、31、 32&34处的突变,同时"c"和"d"是在残基101、102、103、 105&107处具有突变的独立F(ab)库。 图7为在实例4第V部份中描述,得自分别与纯种系235 -5.1、233-5.2、235-5.3和235-5.4中之VH CDR2突变混合的E 26中之VL CDR1突变的最终突变种,再命名为E27、E695 、E696和E697的噬菌体ELISA竞争研究中观察到之光密 度对IgE竞争者抗体浓度的图。 图8为各种浓度的e25、e26和e27抗-IgE抗体,在实例4第 VI部份中描述的生物素平板分析中,在490毫微米处 之吸光度的图。 图9代表e25、e26和e27之F(ab)明显的结合亲和力,系由 BIAcore TM-2000表面质粒基因组共振系统所测量的。 在25℃下,使用20微升/分钟的流速,将1.5连续稀释的 F(ab)抗体片段注射到在PBS/吐温缓冲溶液(在磷酸缓 冲之生理盐水中的0.05%吐温-20)中之IgE片上。从观 察到的每个Fab突变种之kon/koff来计算所示的平衡 解离常数。 图10为质体p426之序列一览表,其系用来作为建构在 实例4中之库-专一性停止模板的模板。 图11A.质体pDH188插入序列的图,其含有编码指向HER-2 受体之Fab人类化抗体之轻链和重链(可双和恒定功 能部位1)的DNA。VL和VH分别是轻链和重链的可变区 。Ck为人类卡巴(kappa)轻链的恒定区。CHlG1为人类 1链的第一个恒定区。这两个密码区都始于细菌 的st II信号序列。 B.含有在11A中描述之插入序列的完整质体pDH188的 图解。在将该质体转化至大肠杆菌(E. coli)SR101细 胞内并加入辅助噬菌体之后,该质体被包装到噬菌 体颗粒内。这些颗粒中有一些表现出Fab-pIII的融 合(其中pIII为由M13基因III DNA编码的蛋白质)。 图12代表抗-IgE抗体E25、E26和E27之全长的重和轻链 残基。 图13代表抗-IgE抗体E26和E27的F(ab)片段。 图14代表抗-IgE抗体E26和E27的sFv片段。 图15代表抗-IgE抗体E26和E27的F(ab)'2片段。 |
