一种蓝藻穿梭质粒表达载体及其用于表达胸腺素α1的方法

摘要

涉及一种基因工程，以从织线藻Plectonema boryanum中提取的内源小质粒pPBS1构建蓝藻穿梭表达载体pPKE2，其有大肠杆菌源和蓝藻源质粒的复制起始位点，有选择标记、启动子、多克隆位点及终止区，可作为外源基因在蓝藻中表达的受体菌，本发明将目的基因胸腺素α1(Tα1)基因和泛素基因融合后插入表达载体pPKE2的多克隆位点，获得含目的基因Tα1的重组质粒，并转化进单胞蓝藻Synechococcus sp.PCC7942中，Southern杂交证实和Western印迹法检测到了Tα1表达产物。

主权项

1.用蓝藻穿梭质粒表达载体pPKEUT表达胸腺素α1的方法，其特征在于首先构建含目的基因Tα1的重组质粒，根据Tα1基因片段两端的序列设计PCR引物T1、T2和T2’，T1(5’端引物)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCT SphI BamHIGTTGACACCAGCFCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3’端引物)：5’-GGGTCGAC TAGTTTTCTGCFTCTTCA SalI SpeIACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’(3’端引物)：5’-GGGTCGAC TAGTTTTCTGCTTCTTC-3’ SalI SpeIPCR扩增得110bp的Tα1DNA片段；选用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2，以质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段，纯化328bp的UB DNA片段和110bp的Tα1DNA片段，用BamHI同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UB Tα1DNA片段，纯化UB Tα1基因片段，用HindIII和SpeI双酶切UB Tα1扩增片段，与用HindIII部分酶切、XbaI完全酶切的蓝藻穿梭质粒表达载体pPKE2连接，连接物转化E.coli JM109，在卡那霉素抗性平板上筛选转化子，得重组质粒pPKEUT；然后用重组质粒pPKEUT转化受体蓝藻synechococcus Sp.PCC7942，所说的载体是来源于pPBS1质粒构建的、含有rbcs polyA终止区表达元件的载体。