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1.一种植物DNA病毒侵染性载体的构建方法，其特征在于，其步骤为： 1)从收集的双生病毒发病株中提取基因组总DNA； 2)以植物总DNA为模板，设计简并引物对双生病毒的两个组分DNA-A和DNA β进行PCR扩增，扩增产物克隆至T-Vector； 3)对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定； 4)序列测定结果通过DNA分析软件进行组合、拼接，获得DNA-A组分和DNA β组分的全长基因组序列； 5)在序列测定的基础上，利用Overlap-PCR和限制性酶切的方法把DNA-A 组分的1.7个重复的基因组构建到改良型植物表达载体pBinPLUS上，获得带有 DNA-A组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞； 6)使用5)中相同的方法把两个正向重复的DNAβ组分构建到改良型植物 表达载体pBinPLUS上，获得带有DNAβ组分的重组植物表达载体，并将其导入 大肠杆菌细胞； 7)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中的带有DNA-A组分的重组植物表 达载体和带有DNAβ组分的重组植物表达载体导入具有较强感染能力的农杆菌 菌株EHA105； 8)重组载体导入农杆菌菌株以后，带有DNA-A和DNAβ的农杆菌接种5mlYEP 液体培养基培养； 9)侵染性测定时，试验植株选用4～6叶充分展开的苗龄期的植株为宜， 接种组合为单DNA-A接种，单DNAβ接种和DNA-A+DNAβ接种； 10)接种时，取1ml一次性针筒吸取农杆菌菌液对植株进行伤口感染，接 种的具体方法和部位：在距离根部1～2cm处取三点进行韧皮部注射，或在叶片 的叶柄处取三点进行注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头对叶脉产生伤 口使菌液进入植株体内； 11)接种植株置于25℃隔离温室培养，接种10～30天后观察接种植株的症 状； 12)对出症状和没有出症状的植株进行ELISA、PCR和SouthernBlot检测 以鉴定其侵染性。 |
