一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法

摘要

本发明公开了一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法，首先是设计合成寡聚脱氧核糖核苷酸引物；其次是将解毒酶基因的cDNA或其氨基酸序列对应的DNA序列与家蚕丝蛋白L链启动子和终止子相连构建融合基因，并一起插入转座因子piggyBac的两个反向重复末端序列之间，得到重组的转座子；第三是用转座酶基因构建转座酶基因表达载体；第四是将得到的重组转座因子和转座酶基因表达载体同时转化家蚕卵；第五是通过培养和筛选被转化的家蚕卵形成的幼蚕，得到稳定表达外源解毒酶脂酶B1的转基因家蚕。本发明方法易行、操作简便、转化率高、家蚕蛹中脂酶B1含量为52％。

主权项

1、一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法，它包括以下步骤：A、设计合成寡聚脱氧核糖核苷酸引物，从幼蚕中取出后部丝腺提取总DNA，以总DNA为模板，分别用引物进行PCR扩增反应，再用限制酶消化，与酶切处理的质粒Bluescript M13连接，筛选重组子，获得PCR扩增片段，克隆的DNA片段分别为家蚕细胞质肌动蛋白基因启动子及编码区序列，家蚕丝心蛋白L链cDNA的核苷酸序列，L链基因启动子片断的核苷酸序列，L链基因3’终止子片断核苷酸序列；B、将解毒酶基因的Cdna或其氨基酸序列对应的DNA序列与家蚕丝蛋白L链基因启动子之后及L链基因终止子之前，构建融合基因，将融基因与报告基因相连，并一起插入转座因子piggyBac的两个反向重复末端序列之间，得到重组子的转座子；C、用转座酶基因构建转座酶基因表达载体；D、将步骤B中得到的重组转座因子和步骤C中得到的转座酶基因表达载体同时转化家蚕卵；E、通过培养和筛选由步骤D中获得的被转化的家蚕卵形成的幼蚕，得到稳定表达外源解毒酶脂酶B1的转基因家蚕。