一种不需要反转录步骤的RNA分子PCR扩增法

摘要

本发明涉及一种不需要反转录的PCR RNA分子扩增法，可用于分子生物学对疾病的诊断。对病原体，尤其是RNA病毒的确诊可广泛用于用血安全等领域，本方法包括产生一种与RNA分子互补的单键DNA保护分子(PS-DNA)，这种约300个硷基对的单键DNA片断，可以和RNA(病毒)分子形成DNA：RNA杂交键。又使用了一种抗体和一种酶将由杂交形成的DNA：RNA杂交链通过特异性抗体结合而分离出来，再把未形成DNA：RNA杂交链的残留PS-DNA降解，然后就可以用常规PCR放大，进行产物检测了。该法与RT-PCR法相比较具有杂交效率高于逆转录效率，特异性强，灵敏度高，成本低，操作方便等特点。将适用于多种临床用核酸检测试剂的配制和生产。

主权项

1.一种RNA分子的PCR扩增法，该方法不需要反转录步骤，它包括下列 步骤： 1)核酸杂交： 将待测样品中加入裂解杂交液，混匀后再加入PS-DNA，65℃保温过夜，再 加入异丙醇沉淀离心后，弃上清液； 2)PS-DNA：RNA杂交链的分离 将上述沉淀物悬浮于含DNA：RNA抗体的磁珠的生理盐水中，在37℃保 温15分钟后收集磁体，用生理盐水洗2次； 3)S1核酸酶消化 将上述磁珠悬浮于含S1核酸酶的消化液中，37℃60分钟，再用生理盐水 洗涤后，收集磁体； 4)PCR反应 将磁珠重新悬浮于上述消化液，98℃10分钟，捕集磁体，取上清液20ul作为 样品加入到预先盛有PCR主反应的反应管中，进行PCR反应，检测产物； 上述步骤(1)中的PS-DNA如下所述制备： 1)取5μlHCV阳性模板(可以是HCV阳性质粒)在100ul反应液中做 PCR；反应液中： 20mMTris(pH8.5) 5mMMgCl₂50mMKCl 0.1％Tween20 50μM每种dNTP 50pmol多量引物 1pmol限量引物 2.5UTaqDNA多聚酶 引物：根据需要可以选择有义引物和反义引物； 2)在PCR基因扩增仪上进行30个循环，参考温度和时间是： 95℃30秒 60℃30秒 72℃2分钟 循环完成后置于72℃5分钟保证最后的延伸； 3)单链DNA产物可以在TBE琼脂凝胶上鉴定，1.4％琼脂，12-15V/cm； 在这种琼脂上单链产物比双链产物跑的速度慢，可以EB染色区分； 4)用终浓度2M醋酸铵，50％异丙醇沉淀浓缩反应液，除去剩余的dNTP和 引物，最后离心获得PS-DNA。