| 主权项 |
1.一种利用乳酸氧化酶(LOD)或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其步骤顺序如下：(1)菌种选择：选用不动杆菌(Acinetobacter sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)之一；(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有1.5～2.0％的琼脂糖并加有0.2～3％DL/L-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25～45℃培养15～30小时；(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的液体基本培养基(BLM)中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得一级种子；(4)扩大培养：以5％(体积比)接种量，接一级种子于300～1000mL含有0.2-3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养：以5％(体积比)接种量，接二级种子于1.8～8L含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，培养15～40小时，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到最高时，终止发酵培养；(6)收集菌体：取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2～3次；再将菌体溶于pH6.0～9.0、20～100mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到50～300克湿细胞/升，或者超声波破碎后，离心得粗酶液，即制成生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)转化实验：将步骤(6)中的生物催化剂与DL/L-乳酸钠混合，使混合物中DL/L-乳酸钠的浓度达到200～700mM；生物催化剂的浓度：湿细胞0.5～8％，粗酶液酶活单位0.5～5U/ml；在5～40℃，pH6.0～9.0条件下，180转/分钟振荡5～30小时，使底物乳酸、生物催化剂与氧气充分混合；(8)分离样品：以5,000～10,000转/分离心5～10分钟，分离步骤(7)中生物催化剂，得到上清液即为样品；(9)样品检测：待步骤(8)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用高效液相(HPLC)测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。 |
