| 主权项 |
1.一种通过悬浮培养植物细胞生产雷公藤总生物碱的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、取正季生长的原生植物嫩叶、茎或当年成熟、饱满的种子，作为诱导愈伤组织的外植体；(2)、表面灭菌：用常规方法灭菌，之后把茎或叶切成0.5公分大小或长短的切片或段，干种子按每颗为单独外植体；(3)、诱导愈伤组织：MS基本培养基加肌醇100mg/L、VB1 0.5-1.0mg/L、VB6 0.5-1.0mg/L、NA 0.5-1.5mg/L、甘氨酸2-10mg/L、蔗糖30-45g/L、2.4-D 1-2mg/L、NAA 0.2-1.0mg/L、琼脂6g/L，PH5.8，灭菌后，把上述切好的外植体接种到培养基上，置于温度为27℃±2℃、暗培养的条件下诱导愈伤组织，种子在光培养条件下发芽，然后，按上、下胚轴、子叶分别接种在上述培养基上，在暗培养条件下诱导愈伤组织；(4)、继代培养：在上述条件下获得的愈伤组织，转移到上述相同的培养基上，在光培养条件下，每35-45天继代一次；(5)、挑选细胞株：从经过3-4次继代培养后的愈伤组织中，挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织；(6)、固体继代保存：步骤(5)挑选得到的生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，部分在上述相同的固体培养基和光培养条件下继代保存，需要时，可省去步骤(1)-(5)，直接从本步骤继代培养的愈伤组织中挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，进入到步骤(7)；(7)、悬浮培养：步骤(5)经挑选出的愈伤组织，另一部分进入本步骤，接种在用上述固体培养基去掉琼脂成分形成的液体培养基中，1500 LUX光照、27℃±2℃的条件下培养，接种后第十天，作第一次继代，以后每7天继代一次，每次倒掉3/4-4/5培养液和细胞，然后加入新鲜的相同培养基到原液面，进行下一次继代；(8)、返回固体培养基：经5-7次继代的悬浮细胞系，在无菌条件下，用150目不锈钢网筛过滤，去掉大块的愈伤组织，滤液用400目筛网过滤，留取悬浮细胞，将悬浮细胞接种到上述固体培养基上，放置黑暗条件下，27℃±2℃，培养三周；(9)、分离大块愈伤组织：从步骤(8)用150目筛网分离挑选出的大块、不分散的愈伤组织，放到上述相同的固体培养基上，进入步骤(10)的继代保存；(10)、大块愈伤组织的保存：将步骤(9)挑选的大块、不分散的愈伤组织，在上述相同的固体培养基上继代保存备用；(11)、分离出分散性好、颗粒状细胞系：步骤8的悬浮细胞，经过三周的固体暗培养后，用100目的筛网分离得到细胞团，为生长快速、颗粒细小的3-8个细胞组成的细胞团。然后进入到步骤12的细胞系悬浮培养：(12)、细胞系悬浮培养：步骤(11)的挑选得到的分散性好、颗粒状细胞系按上述步骤(7)的悬浮培养条件继代培养，形成高等植物的细胞悬浮系；(13)、步骤(12)的悬浮培养细胞系经扩样本后，在磁力搅拌反应器中继代后，第7天加入大块愈伤组织，共同培养72小时，所得到的悬浮细胞和悬浮液中即含有雷公藤总生物碱。 |
