相辅脱氧核糖核酸的合成方法

摘要

本发明公开了一种cDNA的合成方法,包括人工合成DNA－RNA或RNA供体分子、用鼠源逆转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA,在合成第一链cDNA的同时,加入上述供体分子进行逆转录和模板转换反应、用PCR扩增方法合成cDNA第二链。本发明通过在全部第一链cDNA的3’端简易、高效加上一个PCR通用序列,进而高效实现总体cDNA PCR扩增。

主权项

1、一种cDNA的合成方法，其特征在于：包括下列步骤：(1)用常规方法人工合成下列结构式的DNA-RNA或RNA供体分子：5’-------------------****3’，包括①5’OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3’②5’OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3’③5’OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3’④5’OOOOOOOOOOOOOO-GNG3’⑤5’OOOOOOOOOOOOOO-GGN3’⑥5’OOOOOOOOOOOOOO-NGG3’其中Poly＂O＂代表随意DNA或RNA序列，包括25～35个碱基，是引物的结合部位；“G”代表RNA碱基G，“N”代表RNA碱基：A或T、G、C；(2)用鼠源逆转录酶M-MLV采用常规方法以mRNA为模板合成第一链cDNA，在合成第一链cDNA的同时，加入上述供体分子，发生如下方式的逆转录和模板转换反应：当合成第一链cDNA到达mRNA的5’端，第一链cDNA在3’端具有加尾功能而形成的cDNA受体分子，通过分子相辅结合，该受体分子接受反应液中的供体分子，逆转录酶继续把供体分子作为模板继续转录而合成一条和供体分子相辅的序列，即PCR通用序列；5’---------****3’供体分子 PolyA尾 5’ ---------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAA3’ 3’←--------------****yyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyT TTT T TTT5’ 受体分子 oligo-d(T)其中＂x＂代表mRNA，＂y＂代表第一链cDNA；(3)用常规PCR扩增方法合成cDNA第二链，并生成大量扩增产物。5’端引物-----→5’ -------------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAA3’3’ -------------------****yyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyTT T TTT T T5’ ←------- 3’端引物