7－氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7－ADCA)的制备方法

摘要

本文提供一种获得7－氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7－ADCA)的方法。该方法基于使用从A.chrysogenum(也称Cephalosporiumacremonium)直接发酵产生的去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC),然后用酶活D－氨基酸－氧化酶(DAO)和戊二酰－7－ACA乙酰酶(GLA)催化。用A.chrysogenum发酵制备DAOC的方法基于将cefEF基因失活,接着再表达cefE基因生成A.chrysogenumΔcefEF－cefE菌株。本发明包括以下几个部分:(I)将编码酶活去乙酰氧基头孢菌素C合成酶(DAOCS或扩环酶)和去乙酰头孢菌素C合成酶(DACS或羟化酶)的A.chrysogenumcefEF基因失活,(II)在cefEF基因失活的A.chrysogenum转化菌株中表达编码来源于放射菌类DAOCS酶活的cefE基因,(III)形成用重组菌株发酵生产DAOC的方法,(IV)用DAO和GLA酶催化下使DAOC转化成7－ADCA。另外一个可选择的方法,在生产DAOC的A.chrysogenumΔcefEF－cefE菌株中组合表达编码DAO和GLA的基因,或者在A.chrysogenumΔcefEF－cefE中表达编码头孢菌素催化酶的基因直接发酵生成7－ADCA。

主权项

1.一种生产7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)的方法，特征在于它包括以下几个操作步骤：a)失活，在生产头孢菌素C的A.chrysogenum菌株中，存在由cefEF基因编码的酶活去乙酰氧基头孢菌素C合成酶/去乙酰头孢菌素C合成酶(DAOCS/DACS)，通过将该基因阻断，构建一种生产青霉素N的菌株；b)表达，在上述生产青霉素N的菌株中，表达编码酶活去乙酰氧基头孢菌素C合成酶(DAOCS)的cefE基因，构建一种生产去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的菌株；c)在生产DAOC的条件下，培养产DAOC的菌株，并且纯化产生的DAOC；d)用D-氨基酸-氧化酶(DAO)将产生的DAOC生物转化为戊二酰-7-ADCA；e)用戊二酰基转移酶(GLA)将戊二酰-7-ADCA生物转化为7-ADCA；f)纯化生物转化产生的7-ADCA。