| 主权项 |
1.一种编码反式接合I群(Group I)核糖之多核酸, 该核糖之序列为一融合RNA,此融合RNA之序列由如 下组成: (1)一个第一RNA序列,其能够将该核糖对准标的RNA 并与之杂交,该第一RNA序列系对该标的RNA互补之序 列,且该第一RNA序列能与标的RNA充分互补而使得标 的RNA与该核糖之间形成P1螺旋; (2)一个第二RNA序列,其藉由该核糖之反式接合活 性结果而可同线地嵌入标的RNA,其系编码一之序 列,该对宿主细胞有毒性,且其系第13个胺基酸之 甲硫胺酸被异亮胺酸或亮胺酸取代之突变白喉毒 素A(Diphtheria taxin A, DTA),该嵌入作用发生在紧临该 标的RNA之尿嘧啶残基之后的位置,该位置系由该第 一RNA序列决定;及 (3)一个第三RNA序列,其包括衍生嗜热四膜虫( Tetrahymena themophila)I群不表现子之催化核心,该第三 RNA序列其5'端连接至该第一RNA序列且其3'端连接至 该第二RNA序列; 其中该多核酸之表现作用系被操作性连接至转 录活化子蛋白质,GAL4,之表现作用,且其中该第一RNA 序列为杂交至编码该GAL4之RNA的序列。2.根据申请 专利范围第1项之多核酸,其中该多核酸是RNA 。3.根据申请专利范围第1项之多核酸,其中该多 核酸是DNA。4.根据申请专利范围第1项之多核 酸,其中该核糖是原核糖。5.根据申请专利范 围第1项之多核酸,其中该核糖是原核糖,且 该多核酸是RNA。6.根据申请专利范围第1项之多 核酸,其中该核糖是原核糖,且该多核酸 是DNA。7.一种制备转形体之方法,包括将如申请专 利范围第1或2项之多核酸之编码序列嵌入一表 现载体或转移载体,该载体已被操作性连接至能够 于昆虫细胞内作用之启动子,并以该载体转形昆虫 细胞。8.根据申请专利范围第7项之方法,其中该昆 虫是果蝇。9.根据申请专利范围第7项之方法,其包 括将如申请专利范围第5或6项之多核酸的编码 序列嵌入表现载体或转移载体。10.一种活体外反 式接合之方法,此方法包括如下步骤: (1)于反式接合反应混合物中,提供由如申请专利范 围第1项之多核酸所编码之反式接合核糖;及 (2)在该核糖具有反式接合活性之条件下,提供标 的RNA至此反应混合物中,该标的RNA包括互补于该核 糖之第一RNA序列之GAL4编码序列,其中该核糖 之第二RNA序列共线地被转移至该标的RNA。11.根据 申请专利范围第10项之方法,其中该核糖是原核 糖。12.一种活体外反式接合之方法,该方法包括 以下步骤: (1)提供如申请专利范围第1项之多核酸至昆虫细 胞中; (2)于该昆虫细胞中表现由该多核酸所编码之反 式接合核糖; (3)于昆虫细胞中表现该核糖之受质,其中该受质 是标的RNA,该标的RNA系包括互补于该核糖之第一 RNA序列的GAL4编码序列;及 (4)于该昆虫细胞中催化该核糖之第二RNA序列与 此受质之反式接合。13.根据申请专利范围第12项 之方法,其中该核糖是原核糖。14.一种活体外 钝化标的RNA活性之方法,该方法包括: (1)提供根据申请专利范围第1项之多核酸所编码 之反式接合核糖至反式接合反应混合物中,该核 糖对标的RNA具催化活性,该催化活性造成该标的 RNA作用之钝化; (2)提供该标的RNA至该混合物中,其中该标的RNA包含 互补于该核糖之第一RNA序列的GAL4编码序列;及 (3)提供条件以令该核糖表现该催化活性。15.根 据申请专利范围第14项之方法,其中该核糖是原 核糖。16.一种提供欲求之遗传序列至昆虫细胞 中之活体外方法,该方法包括: (1)提供根据申请专利范围第1项之多核酸至该昆 虫细胞,该核糖具有对标的RNA之催化活性; (2)于该昆虫细胞中提供该标的RNA,其中该标的RNA含 有互补于该核糖之第一RNA序列的GAL4编码序列; (3)提供条件以令该核糖可共线地将该核糖之 第二RNA序列转移至该标的RNA之中,藉此提供该所欲 之遗传序列至该昆虫细胞。17.根据申请专利范围 第16项之方法,其中该核糖是原核糖。图式简 单说明: 第一图说明I群不表现子核糖接合之机制。 第二图说明(A)嗜热四膜虫rRNA不表现子;(B)标的mRNA 及本发明的反式接合核糖。 第三图(A)为CAT-LacZ -反式接合核糖之设计图 ;3(B)是CAT-LacZ核糖完整的RNA表现子。 第四图代表黄爪花叶病毒(CMV)RNA4反应接合核糖 之序列。A:病毒RNA标的序列,B:寡核酸标的序列;C :CMV RNA4-白喉毒素A链反式接合核糖。 第五图为黄爪花叶病毒3/4序列之比较。 第六图(A)为Gal-4-白喉毒素A(DTA)反式接合核糖之 设计;(B)为Gal-4-DTA核糖之完全编码序列,其中有 异白胺酸之置换。 第七图图示P-要件调介之〝加强子-捕获〞方法,以 表现Gal 4蛋白质。 第八图示出野生型DTA及DTA 3'表现子突变株之部份 序列。 第九图为pGaTB及pGaTN之图示。 第十图为pUSAT图示。 第十一图为可表现Gal4-DTA反应接合核糖之果蝇 胚胎之外皮制剂。 第十二图代表〝原一核糖〞设计之原则。箭头 示出核糖解离位置,〝抗意识〞区以黑色标出, 催化区以阴影区表示,且3'〝表现子〞序列示于右 阴影处。于标的mRNA不存在下,反式接合核糖可 暂时地硷基配对,并与异质序列(包括其本身)反应 。此外,在3'〝表现子〞接头会断开。构筑钝化的 〝原核糖〞以含有额外的自身互补序列,其使核 糖之催化中心错误地折叠,只有在欲求之标的 mRNA与之硷基配对后才会形成具活性之核糖,且 因此取代干扰的二级结构。 第十三图示出CAT-LacZ反式接合核糖之序列及所 预测之二级结构。核糖〝核心〞序列以阴影标 出(依循Cech,Gene 73:259-271(1988))。螺旋P8于未经修饰 之核糖及1及2号原核糖中示出,其分别有13个 及18个核酸与〝抗意识〞区之序列互补(突显出 来)。 第十四图示出:(1)图示之活性CAT-LacZ核糖,具有〝 抗意识〞核糖区,及P8螺旋和3'〝表现子〞序列;( 2)(a)钝化的CAT-LacZ原核糖2,在经修饰之螺旋P8及 〝抗意识〞区之间的序列有硷基配对情形;及(b)活 化之原-核糖,于与CAT mRNA硷基配对后,置换螺旋P8 -〝抗意识〞配对,及螺旋P8之再形成。 第十五图示出CAT-LacZ原核糖转录子之安定性。 含有CAT-LacZ核糖及原核糖序列之质体,以EcoRI 解离,并以T7或SP6 RNA聚合及[32-P]UTP转录。经放射 标的之转录子以5%聚丙烯醯胺凝胶电泳,于7M尿素 与25%甲醯胺中分级分离,再放射自显之。核糖体转 录子进行充份之水解作用,主要在〝3'表现子〞接 头。原核糖型式显着地较不具反应性。 第十六图示出CAT-LacZ原核糖之核糖核酸内切 活性。含有CAT-LacZ核糖及原核糖序列之质体, 以ScaI解离,并以T7或SP6 RNA聚合转录。转录子在37 ℃、45℃及50℃下于40mM Tris-HCl pH7.5,6mM MgCl2,2mM亚精 胺,10mM NaCl,2mM GTP加上放射标的之CAT RNA,共置30',以T 7 RNA聚合自经PuvII切割之质体处开始转录。产物 以5%聚丙烯醯胺凝胶,于7M尿素及25%甲醯胺中电泳, 再放射自显之。173nt之CAT RNA,其RNA调介之解离可产 生分为76nt及97nt之5'及3'片段。 第十七图示出用于设计原-核糖之〝野生型〞及 经修饰之螺旋P8,可能的硷基配对示于图中。互补 于相当的原核糖〝抗意识〞部份之硷基示以粗 字体。互补硷基之数目示于各螺旋下。螺旋以相 当的原核糖转录子之安定性排列,系于活体外转 录作用中侦测〝3'表现子〞水解作用之程度。 第十八图示出GAL4-DTA原核糖之安定性。含有核 糖及原核糖序列之质体,以XhoI线化,再以T7 RNA 聚合转录。转录子在50℃下与40mMTris-HCl pH7.5,6mM MgCl2,2mM亚精胺,10mM NaCl,1mM GTP共置60',再于5%聚丙烯 醯胺凝胶中以7M尿素及25%甲醯胺电泳,再放射自显 之。在这些条件下,核糖转录子会充份水解,而 原核糖1号较差,2号则稳定。 |
