| 主权项 |
1.一种用于治疗特征为不正常细胞增殖之哺乳动 物疾病之医药组合物,其包含: a.有效剂量的编码表现p94RB之载体,其用于投至罹 患特征为不正常增殖细胞之疾病之哺乳动物,如此 该表现载体可嵌入该不正常增殖细胞中,该表现载 体含有编码p94RB之基因;以及 b.该不正常增殖细胞中之p94RB之表现产物,其量足 以抑制该不正常增殖细胞之增殖;且其中该编码表 现p94RB之载体含有p94RB编码基因,该基因可编码胺 基酸序列实质上依据SEQ ID NO:3之蛋白质,限制条件 为该蛋白质并非p110RB。2.根据申请专利范围第1项 之医药组合物,其中该p94RB编码基因可编码具胺基 酸序列依据SEQ ID NO:3之蛋白质。3.根据申请专利范 围第1项之医药组合物,其中该p94RB编码基因具有实 质上依据SEQ ID NO:1之DNA序列。4.根据申请专利范围 第3项之医药组合物,其中该p94RB编码基因具有依据 SEQ ID NO:1之DNA序列。5.根据申请专利范围第2项之 医药组合物,其中该表现载体选自由质体及病毒载 体组成之集团中。6.根据申请专利范围第4项之医 药组合物,其中该表现载体选自由质体及病毒载体 组成之集团中。7.根据申请专利范围第5项之医药 组合物,其中该病毒载体选自由反转录病毒载体, 腺病毒载体及庖疹病毒载体所组成之集团中,其中 该p94RB编码基因系在选自由反转录病毒启动子、 腺病毒启动子、CMV启动子及-肌动蛋白启动子组 成之集团中之启动之控制之下。8.根据申请专利 范围第6项之医药组合物,其中该病毒载体选自由 反转录病毒载体,腺病毒载体及庖疹病毒载体所组 成之集团中,其中该p94RB编码基因系在选自由反转 录病毒启动子、腺病毒启动子、CMV启动子及-肌 动蛋白启动子组成之集团中之启动之控制之下。9 .根据申请专利范围第8项之医药组合物,其中该表 现载体系选自由质体pCMV-s-RB42及质体pA-s-RB34所 组成之集团之中。10.根据申请专利范围第7.8或9项 之医药组合物,其中该表现载体以选自下列之方法 嵌入捷不正常增殖之细胞中,包括病毒感染或转导 作用,脂质体-调介之转感作用,勃里平(Polrbrene)调 介之转感作用及CaPO4调介之转感作用。11.根据申 请专利范围第1项之医药组合物,其中该不正常增 殖的细胞为肿瘤或癌细胞,且该哺乳动物是人类。 12.根据申请专利范围第11项之医药组合物,其中该 肿瘤或癌细胞系选自由癌及肉瘤细胞组成之集团 。13.根据申请专利范围第11项之医药组合物,其中 的肿瘤或癌细胞系选自由膀胱癌、肺癌、乳癌、 前列腺癌、纤维肉瘤、骨肉瘤、及颈癌组成之集 团。14.根据申请专利范围第11项之医药组合物,其 中该肿瘤或癌细胞为具有至少一种遗传上缺失之 肿瘤抑制基因或致癌基因之细胞,基因选自由RB、p 53.c-myc、N-ras、c-yes-1基因所组成之集团。15.根据 申请专利范围第11项之医药组合物,其中该肿瘤或 癌细胞具肿瘤抑制基因无可测及之遗传缺失,且肿 瘤抑制基因选自由RB基因及p53基因组成之集团。16 .根据申请专利范围第12项之医药组合物,其中该癌 细胞为膀胱癌细胞,且投予该表现载体以治疗膀胱 癌细胞之步骤系经由将该表现载体输注至需此治 疗之膀胱中。17.一种编码胺基酸序列实质上依据 SEQ ID NO:3之p94RB之DNA分子,SEQ ID NO:3: ; 限制条件为该DNA分子并不同时编码p110RB。18.根据 申请专利范围第17项之DNA分子,该DNA分子可编码胺 基酸序列依据SEQ ID NO:3之蛋白质。19.根据申请专 利范围第17项之DNA分子,该DNA分子具有实质上依据 SEQ ID NO:1之DNA序列, 及其简并序列; 限制条件为该DNA分子并不同时编码p110RB。20.根据 申请专利范围第17项之DNA分子,该DNA分子具有依据 SEQ ID NO:1之DNA序列。21.一种表现载体,其含有根据 申请专利范围第18项之DNA分子,可将该p94RB编码DNA 分子嵌入哺乳动物宿主细胞中并在其中表现p94RB 。22.一种表现载体,其含有根据申请专利范围第20 项之DNA分子,可将该p94RB编码DNA分子嵌入哺乳动物 宿主细胞中并在其中表现p94RB。23.根据申请专利 范围第21项之表现载体,其中该表现载体系选自由 质体及病毒载体组成之集团中。24.根据申请专利 范围第22项之表现载体,其中该表现载体选自由质 体及病毒载体组成之集团中。25.根据申请专利范 围第23项之表现载体,其中该病毒载体选自由反转 录病毒载体、腺病毒载体及庖疹病毒载体所组成 之集团中,且其中该p94RB编码基因是在选自由反转 录病毒启动子、腺病毒启动子、CMV启动子及-肌 动蛋白启动子组成之启动子控制之下。26.根据申 请专利范围第24项之表现载体,其中该病毒载体选 自由反转录病毒载体、腺病毒载体及庖疹病毒载 体所组成之集团中,且其中该p94RB编码基因是在选 自由反转录病毒启动子、腺病毒启动子、CMV启动 子及-肌动蛋白启动子组成之启动子控制之下。 27.根据申请专利范围第24项之表现载体,其中该表 现载体是质体pCMV-s-RB42及质体pA-s-RB34。28.一种 适合治疗哺乳动物肿瘤或癌之组成物,其中包括有 效剂量的根据申请专利范围第21项之表现载体,加 上适合的载剂或赋形剂。29.一种适合治疗哺乳动 物肿瘤或癌之组成物,其中包括有效剂量的根据申 请专利范围第22项之表现载体,加上适合的载剂或 赋形剂。30.一种根据申请专利范围第28或29项之组 成物,其中该载剂或赋形剂包括包胶之脂质体。31. 一种p94RB蛋白质,其包括具有胺基酸序列实质上依 据SEQ ID NO:3之多, 限制条件为该蛋白质非p110RB。32.根据申请专利范 围第31项之p94RB蛋白质,其包括具有胺基酸依据SEQ ID NO:3之多。33.一种适合治疗哺乳动物肿瘤或癌 症之组成物,其中包括有效剂量的根据申请专利范 围第31项之p94RB,加上适合的载剂或赋形剂。34.一 种适合治疗哺乳动物肿瘤或癌之组成物,其中包括 有效剂量的根据申请专利范围第32项之p94RB,加上 适合的载剂或赋形剂。35.根据申请专利范围第33 或34项之组成物,其中该载剂或赋形剂包括包胶之 脂质体。36.一种产制p94RB蛋白质之方法,其包括以 下步骤: a.将含有p94RB编码基因之可相容的表现载体嵌入宿 主细胞中,其中该p94RB编码基因为 ,或其简并序列;及 b.含该宿主细胞表现p94RB蛋白质。37.根据申请专利 范围第36项之方法,其中该宿主细胞选自由原核宿 主细胞及真核宿主细胞组成之集团中。38.根据申 请专利范围第32项之方法,其中该真核宿主细胞是 哺乳动物宿主细胞,且该表现载体系可与该哺乳动 物宿主细胞相容的。39.根据申请专利范围第38项 之方法,其中该表现载体选自由质体pCMV-s-RB42及质 体pA-s-RB34所组成之集团之中。40.根据申请专利 范围第37项之方法,其中该宿主细胞是昆虫宿主细 胞且该表现载体是可与昆虫宿主细胞相容的质体 或病毒载体。41.根据申请专利范围第40项之方法, 其中该杆病毒载体是AcMNPV-RB94。42.一种用于活体 外治疗哺乳动物不正常增殖细胞之套组,其包含: a.需治疗之哺乳动物之组织样品,该组织样品中含 有不正常增殖之细胞; b.有效剂量的p94RB编码表现载体,其用于与需治疗 之组织样品接触;及 c.于该不正常增殖细胞中p94RB之表现产物,其量可 有效地抑制不正常细胞之增殖; 其中该经治疗之组织样品再回至哺乳动物中,或置 放组织样品于另一哺乳动物。43.一种用于治疗哺 乳动物中疾病特征为不正常细胞增殖之医药组合 物,其包含p94RB蛋白质,可投予至具疾病特征为不正 常增殖细胞之哺乳动物,如此该p94RB蛋白质嵌入不 正常增殖细胞中,其量足以有效抑制该细胞之不正 常增殖。44.根据申请专利范围第43项之医药组合 物,其中该p94RB蛋白质具有实质上依据SEQ ID NO:3之 胺基酸序列,限制条件为该蛋白质非p110RB。45.根据 申请专利范围第43项之医药组合物,其中该p94RB蛋 白质具有依据SEQ ID NO:3之胺基酸序列。46.根据申 请专利范围第43项之医药组合物,其中该不正常增 殖细胞为肿瘤或癌细胞,且该哺乳动物是人类患者 。47.根据申请专利范围第46项之医药组合物,其中 该P94RB蛋白质是包胶于脂质体载剂中,且p94RB蛋白 质嵌入不正常增殖细胞中,其系将以脂质体包胶之 p94RB蛋白质与不正常增殖的细胞融合。48.根据申 请专利范围第46项之医药组合物,其中该肿瘤或癌 细胞选自由膀胱癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、纤 维肉瘤、骨肉瘤、及颈癌组成之集团中。49.根据 申请专利范围第46项之医药组合物,其中该肿瘤或 癌细胞为具有一种以上遗传缺失之肿瘤抑制基因 及致癌基因之细胞,基因选自由RB、p53.c-myc、N-ras 、c-yes-1基因组成之集团中。50.根据申请专利范围 第46项之医药组合物,其中该肿瘤或癌细胞为具有 肿瘤抑制基因无可测及之遗传缺失之细胞,基因选 自由RB基因及p53基因组成之集团中。51.根据申请 专利范围第48项之医药组合物,其中该肿瘤或癌细 胞为肺癌细胞,且投予p94RB蛋白质以治疗肺癌细胞 之步骤系利用将有脂质体包胶之p94RB蛋白质输注 至需此治疗之呼吸道及肺部。52.一种用于活体外 治疗哺乳动物不正常增殖细胞之套组,其包含: a.需此治疗之哺乳动物之组织样品,该组织样品中 含有不正常增殖之细胞;及 b.有效剂量的p94RB蛋白质,其用于与需治疗之组织 样品接触; 其中该经治疗之组织样品再回至哺乳动物中,或组 织样品置入另一哺乳动物中;且该p94RB蛋白质具有 实质上依据SEQ ID NO:3之胺基酸序列。53.一种用于 治疗不正常增殖细胞之医药组合物,其包含: a.p94RB编码表现截体,其可用于嵌入哺乳动物不正 常增殖细胞中;及 b.于其中之p94RB之表现产物,其量足以抑制来自体 内该不正常增殖细胞之增殖,且该p94RB编码表现载 体包括有p94RB编码基因,该基因编码具有胺基酸序 列实质上依据SEQ ID NO:3之蛋白质,该蛋白质不是p110 RB。图式简单说明: 第一图:编码94kD治疗性RB蛋白质之cDNA片段之核 酸序列(正股为SEQ ID NO:1,质股为SEQ ID NO:2)。 第二图:94 kDa治疗性RB蛋白质之胺基酸序列(SEQ ID NO :3)。 第三图:构筑杆病毒表现载体以合成94 kDa治疗性RB 蛋白质;*R.S.是重组序列。 第四图:重组杆病毒所产生的p110RB及p94RB于昆虫细 胞内之细胞内位置:A图示出伪感染之Sf9细胞;B图示 出可产制p110RB之细胞;且C图示出产制p94RB之细胞; 可注意到蛋白质系位在B及C图中之核内。蛋白质 定位可由抗一RB免疫化学染色完成。 第五图:示出由杆病毒表现且再予以纯化之p110RB及 p94RB蛋白质与SV40 T抗原形成复合物之图解。以免 疫亲和力层析纯化之蛋白质与等量的T抗原混合, 取一份组合物以PAB419抗一T抗体行免疫沉淀,之后 再行西方墨点分析。吸渍物与MAb-1抗-RB抗体及PAB 419抗体相继培育。第1列:以经T-抗原不朽化之W138 VA13纤维母细胞之溶胞产物充作对照组;2列:经纯化 之p110RB;3列:T-Ag与p110RB共沉淀;4列:经纯化之P94RB;5 列:T-Ag与p94RB共沉淀。 第六图:构筑重组质体,以于人类细胞中利用巨细 胞病毒启动子/加强子可高水平表现p110RB(pCMV-f-RB35 )及p94RB(pCMV-s-RB42)蛋白质:A图是p110RB编码cDNA之说明 图;B图提出p110RB及p94RB表现质体之舆图,其中pCMV-f- RB35指导合成p110RB,而pCMV-s-RB42指导合成p94RB。应注 意到pCMV-s-RB42使p110RB在第二ATG上游的编码区己大 半被删去。 第七图:构筑重组质体以于人类细胞中利用-肌 动蛋白启动子表现p110RB(pA-f-RB35)及p94RB(pA-s-RB 34):A图是p110RB编码质体,pA-f-RB33之舆图;B图是p94RB 编码质体,pA-s-RB34之舆图。应注意到pA-s-RB34使 p110RB在第二ATG上游的编码区己大半被删去。 第八图:p110RB及p94RB表现在RB缺失之膀胱癌细胞株 5637(ATCC HTB9)上之外形作用:A图为伪感染之HTB9细胞; B图是表现p110RB之HTB9转感细胞;C图是表现p94RB之HTB9 转感细胞。箭号表示呈RB阳性之经免疫染色之细 胞。可注意到B图中表现p110RB之细胞似乎正常,但C 图中表现p94RB之细胞则衰老。 第九图:p110RB及p94RB蛋白质在RB-重新构成之膀胱癌 细胞株,5637上之半衰期分析。膀胱肿瘤细胞在多 个皿中为p110RB(pA-f-RB33)或p94RB(pA-s-RB34)表现质 体的转感。经转感24小时后,细胞标以[35S]-甲硫胺 酸,并以过量未经标记之甲硫胺酸分别追加0,6,12及 24小时。以免疫沉淀决定p110RB及p94RB蛋白质;图左 侧(0-12小时)显示p110RB之半衰期少于6小时;图右侧(0 -24小时)显示p94RB之半衰期约12小时。 第十图:在瞬时转感的5637细胞中,外来的p110RB及p94 RB蛋白质之西方墨点分析,显示出p94RB蛋白质不同 的未磷醯化状况:1列示出正常的人类纤维母细胞 株,WI-38;2列显示出亲代RB(-)之膀胱癌细胞株,5637;3 列显示出以表现p110RB之质体所转感之5637细胞;4列 示出为表现p94RB之质体所转感之5637细胞。 第十一图示出在正常(非肿瘤形成)的老鼠纤维母 细胞中,经由反转录病毒质体载体表现人类全长的 RB蛋白质,p110RB(B图)及广效的肿瘤抑制蛋白质,p94RB( C图)。p110RB及p94RB-表现细胞(箭号)均具有类似亲代 细胞(A图)正常之存活外形。 第十二图于老鼠尿道膀胱粘膜中活体内表现人类p 110RB(C图)及p94RB(D图)蛋白质。脂质体分别与p110RB- 及p94RB-表现质体混合,经由导管直接融合至老鼠膀 胱。値得注意的,表现p110RB(C图,箭号)或p94RB(D图,箭 号)之过渡上皮,均保有类似未经处理之膀胱(A图) 或仅以脂质体处理之老鼠膀胱(B图)对应部份之正 常且存活之外形。 |
