猪霉浆菌肺炎疫苗之制法

摘要

猪霉浆菌肺炎是由Mycoplasma hyopneumoniae所引起的呼吸道疾病，是世界上最重要的猪只疾病。它是一种慢性非致死性，但任何年龄均可感染的疾病。由于本病造成猪只饲料效率降低和生长缓慢，因此经济损失相当严重。为预防控制本病，过去有很多学者从事疫苗的研究，但均没有良好预防效果，因此目前世界上尚未有商品化的疫苗上市。为了开发出有效的疫苗，发明人前后共花费了十年的时间从事 Mycoplasma hyopneumoniae抗原特性、培养基、血清学及免疫学等一系列的基础研究。从这些研究的结果并参考别人的文献因而开发出本疫苗作为猪霉浆菌肺炎控制之用。本发明所用的菌株－PRIT-5菌株是从83个野外分离菌株用代谢抑制试验所筛选出来的，其抗原性很强且增殖快速，在35-38℃培养48-72小时后菌体力价高达10^9-10ccu/ml。本疫苗包含有菌体抗原(10^9-10ccu/ml)及水溶性抗原(50μg/ml)，这种完整性抗原是制备疫苗最适当的免疫原，而所制备之疫苗将可保护猪只对抗病原的感染。本疫苗的制备过程相当简单、安全，而且成本很低，因此认为很适合于商品化疫苗。

主权项

1﹒一种菌株分离筛选之方法,其包括(1)猪肺炎霉浆菌(Mycoplasmahyopneumoniae)PR1T─5菌株是从本省猪只感染到本病的肺脏分离的83个分离菌株,利用代谢抑制试验(MetabolicInhibitiontest,MI)及增殖试验所筛选出来的特殊菌株;(2)PTIT─5菌株的抗原性特强,在MI测定中其抗原力价高达1024倍,其他分离株及标准菌株(J菌株)的MI力价只有64─256倍;(3)PRIT─5菌株增殖非常快速,在培养基中35─38℃培养48─72小时,其力价可达到10^9─10c﹒c﹒u﹛@鶔禲]c﹒cu=colorchangeunits),式@茖銗L菌株均在10^8─9c﹒c﹒u/ml左右。2﹒如申请专利范围第1项之方法,其中培养基成份如下:Hanks'solution600─800ml蒸馏水900─11╮@砭砭鶔穮苠憸諲 驒磝憸鞥髍艟瞱憸 鞥髍谡 鞥驒騿]╮@牶鞥谡諲驉^10─13gmBactoPPLObroth1╮@陕w13gmYeastextract80─100mlHE╮@煍荎屣磝谡谡瞱揣w8gm猪血清400─500ml(猪式@撗M先在56℃30分钟非动化后置于37℃48小时离心将沉鴃@咱h除)培养基配好后调整pH到7﹒4─7﹒6,然后以0﹛@O2的Millipore滤纸无菌过滤。3﹒一种制备猪霉浆菌肺炎疫苗之方法,包括:(1)菌株(PRIT─5)在疫苗培养基中培养于37℃的恒温振荡器中48─72小时。(2)用高速冷冻离心机以16000xg在4℃离心一小时。(3)取上清液以Amico公司出品的过滤器过滤收集过滤液后用UV─spectrophotometer以280波长测定蛋白质浓度(约为40─60g/ml)。(4)再将此过沈液以0﹒2Millipore滤纸无菌过滤,此即为水溶性抗原。(5)将高速冷冻离心机打下来的菌体与水溶性抗原混合,加入0﹒1─0﹒2%的福尔马林在4─6℃过夜,第二天加入NaHSO3中和。(6)将此福尔马林处理过的疫苗3份加入1份氢氧化铝胶用搅拌器充分混合均匀制成疫苗置于4℃备用。(7)疫苗以2ml为一剂量使用,因此含苗体数约为1﹒510^9─10ccu/1剂量,而含水溶性抗原约为65─80ㄐ@gg/1剂量。4﹒如申请专利范围第3项之方法,其中培养基成份:Hanks'╮@驒穮 鞥驒髍窖砭砭w800ml蒸馏水900─1100╮@鶔穮苠憸諲 驒磝憸鞥髍艟瞱憸 鞥髍谡屣鞥摃騿]Di╮@谡諲驉^10─13gmBactoPPLObroth11─╮@陕甜鸺鶔蝣瞱憸 瞨Atract80─100mlHEPE╮@屣磝谡谡瞱揣w8gm猪血清400─500ml(猪血清央@b56℃30分钟非动化后置于37℃48小时离心将沉淀物央@h除)培养基配好后调整pH到7﹒4─7﹒6,然后以0﹒2ㄐ@g的Millipore滤纸无菌过滤。5﹒一种预防猪肺炎动物用药组成物,系以申请专利范围第3项之方法所制得之疫苗为主要成份。