一种基于柑橘全爪螨几丁质酶基因的RNA干扰载体制备方法

摘要

本发明公开了一种基于柑橘全爪螨几丁质基因的RNA干扰载体制备及应用方法，通过BLAST搜索，从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出13条几丁质酶基因，从中挑选Unigene7021进行真实性检测，然后在NCBI上搜索比对保守序列，合成对应的dsRNA，将正、反向几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi载体“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，将构建的载体转入农杆菌感受态中，进而将农杆菌侵染植株获得转基因柑橘材料。

主权项

一种基于柑橘全爪螨几丁质酶基因的RNA 干扰载体制备方法，其特征在于，通过BLAST 搜索，从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出13 条几丁质酶基因，从中挑选Unigene7021 进行真实性检测，然后在NCBI 上搜索比对保守序列，合成对应的dsRNA，将正、反向几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi 载体“PFGC‑7021P1F1/7021P2F2”，将构建的载体转入农杆菌感受态中，进而将农杆菌侵染植株获得转基因柑橘材料；通过柑橘全爪螨转录组搜索，获得几丁质酶基因Unigene7021，对该基因序列进行真实性检测后，在NCBI 上比对找出保守序列设计构建dsRNA；所述几丁质酶基因Unigene7021的序列如序列表SEQ ID NO:1 所示；将正向目标基因7021P1F1 质粒双酶切，同时将载体PFGC5941 质粒用相同两个酶酶切；用T4 连接酶将其连接，然后将连接产物转化大肠杆菌，随机挑选单克隆用通用引物P1，F1，PCR 检测筛选正确的菌株，提取质粒，然后酶切验证得到“PFGC‑7021P1F1”；将得到的“PFGC‑7021P1F1”质粒双酶切，同时相同酶切反向目标基因7021P2F2，T4 连接酶连接，转入大肠杆菌随机挑选单克隆，酶切验证，得到“PFGC5941‑正向片段7021P1F1/反向片段7021P2F2”；将获得的农杆菌LBA4404 菌株侵染外植体，并进行分子检测：所述正向片段7021P1F1的序列如序列表SEQ ID NO:2 所示，所述反向片段7021P2F2的序列如序列表SEQ ID NO:3 所示；将准备好的外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养皿中，侵染；将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接；提取转基因柑橘苗和其阴性对照植株的基因组DNA，并采用基于GUS 基因序列的特异引物进行扩增、电泳检测。