分泌表达GLP-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用

摘要

一种分泌表达GLP‑1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用，是通过化学合成人源胰高血糖素样肽I基因，简称GLP‑1，即1‑37个氨基酸的有效功能区域，并加入真核细胞特有的分泌表达穿膜肽基因,构建pLive‑GLP‑1重组质粒，电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，实现GLP‑1的分泌表达，并通过口服或静脉注射进入人体血液循环后可以实现GLP‑1的持续表达，实现对II型糖尿病病症的缓解和治疗作用。

主权项

一种分泌表达GLP‑1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法，其特征在于：一、pLive‑GLP‑1重组质粒构建a)通过生物信息学分析，选择GLP‑1氨基酸序列1‑37，同时设计在GLP‑1前面加一穿膜肽，序列N端和C端加NheI和BamHI两个酶切位点。之后将设计好的序列交测序公司合成，得到pUC57‑GLP‑1重组质粒；b)构建pLive‑GLP‑1重组质粒A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pLive，pUC57‑GLP‑1质粒；B酶切pLive，pUC57‑GLP‑1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；C配制2％琼脂糖凝胶电泳；110V电压下电泳45min，在片段168bp和载体3400bp切胶回收；D酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；E转化a从‑80℃冰箱中取200μL Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；c42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3‑5min；d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min；弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含50ng/μL Kan的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16‑24h，挑取单克隆；F送公司测序；G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pLive‑GLP‑1，保存备用，步骤同步骤一；二、pLive‑GLP‑1电转减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009A减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态制备a取‑80℃冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009接种于5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养；b将获得菌液按照1％接种于LB液体培养基中，37℃静置培养至菌体OD₆₀₀值为0.3‑0.4，收集备用；c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；d沉淀用冰冷的10％甘油溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；e最后沉淀重悬于1/100体积10％甘油溶液中，冰浴10min后使用；B减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009电转化a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的LB液体培养基中，37℃培养1.5h，取100μL转化后产物涂布在含有50ng/μL Kan抗性的LB平板上，37℃静置培养12h，筛选阳性克隆子；三、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009与人源胚胎肾细胞293‑T细胞共培养A将293‑T细胞按照50000个/孔接种到24孔板中,第二天备用；B将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009复苏，过夜培养；C当VNP2009长至10⁸CFU/mL，采用等体积不含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基洗涤细菌3次，按照细菌：细胞200：1接种24孔板，处理6‑8h；更换含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，处理36h；D收集细胞培养的上清和沉淀进行蛋白检测；四、Western检测pLive‑GLP‑1在293‑T细胞中的分泌表达A电泳a配制12％SDS‑PAGE凝胶b样品处理将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液，终浓度为1×，100℃或沸水浴加热3‑5分钟，以充分变性蛋白；c上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS‑PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS‑PAGE电泳液；100V电泳90～120min；B Western检测a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1‑2分钟，以洗去膜上的转膜液；c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；d兔源GLP‑1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。