人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克隆抗体的制备工艺

摘要

本发明公开了一种人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克隆抗体的制备工艺。本发明运用DEAE‑Sepharose Fast Flow(DEAE‑S)离子交换柱、分子筛(Superdex 75、Sephacryls‑200)及疏水柱Phenyl Sepharose^TM High Performance(PHSP)等多种色谱柱分离技术，成功地从肾脏损伤患者的尿液中进行人源视黄醇结合蛋白的纯化，最大程度地保留了RBP蛋白的免疫原性。将获得的人源RBP抗原用于免疫动物，从而获得抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体。所得抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体可应用于免疫比浊试剂盒。

主权项

从尿液中提取纯化人视黄醇结合蛋白的工艺，包括以下步骤：1)从肾脏损伤患者的尿液中获取尿蛋白液；2)所得的尿蛋白液过DEAE‑Sepharose Fast Flow凝胶柱层析，用缓冲液B1平衡后再用缓冲液B2洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并含RBP的部分，得到RBP组分1；其中：缓冲液B1：15～25mM Tris‑HCl pH7.5～8.0+40～50mM NaCl+0.01～0.03％NaN₃+1～2mM EDTA；缓冲液B2：15～25mM Tris‑HCl pH7.5～8.0+250～350mM NaCl+0.01～0.03％NaN₃+1～2mM EDTA；3)将RBP组分1用硫酸铵盐析，使其中硫酸铵的饱和度为55～65％，离心，收集蛋白沉淀，所得蛋白沉淀用缓冲液C复溶，离心，取上清液经Sephacryls‑200分子筛凝胶层析,用缓冲液C洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于80％的部分，得到RBP组分2；其中：缓冲液C：15～25mM Tris‑HCl pH7.5～8.0+100～150mM NaCl+0.01～0.03％NaN₃+1～2mM EDTA；4)向RBP组分2中添加饱和硫酸铵溶液直至其中硫酸铵的饱和度为25～30％，然后过Phenyl Sepharose^TM High Performance疏水柱，用流动相梯度洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于90％的部分，得到RBP组分3；其中：所述的流动相由缓冲液A和缓冲液D组成，缓冲液A：15～25mM Tris‑HCl pH7.5～8.0+0.01～0.03％NaN₃+1～2mM EDTA；缓冲液D：15～25mM Tris‑HCl pH7.5～8.0+25～30％硫酸铵+0.01～0.03％NaN₃+1～3mM EDTA；5)将RBP组分3用硫酸铵盐析，使其中硫酸铵的饱和度为55～65％，离心，收集蛋白沉淀，所得蛋白沉淀用缓冲液C复溶，离心，取上清液经Superdex 75分子筛凝胶层析,用缓冲液C洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于97％的部分，得到RBP组分4；6)取RBP组分4上偶联α₁‑MG多抗的CNBr‑activated Sepharose 4B柱层析，收集流出液，Western Blotting检测，得到RBP抗原。