一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法。该方法选择毒性敏感的单细胞斜生栅藻作为受试生物，对待测水样实验组和空白对照组进行24h适应性培养，测量两组样品藻类的快相叶绿素荧光，分析获得主导光合作用能量传递过程的荧光参数，计算出实验组的待测水体对藻类光合作用的抑制率，根据物质毒性强度与光合作用抑制率间的剂量‑效应关系，计算得到待测水体的综合毒性强度。该方法具有毒性响应灵敏、测试简单快速等特点，是生态风险快速评价和突发性污染事故应急监测的新手段。

主权项

一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)受试藻类培养以斜生栅藻作为受试生物，并配制SE培养基，高温高压灭菌，将藻种转接到培养基中，放入光照培养箱中进行扩大、驯化培养和藻种转接，使藻种达到纯化和同步生长，培养条件设置如下：光照2000‑3000lux、光暗比14h:10h、pH值8±1、温度25±2℃，每日摇动1次，在藻类培养过程中，定期利用显微细胞计数法测量藻类细胞生物量，绘制藻类生长曲线，最终得到处于对数生长期，细胞浓度在10⁴Cell/mL量级的受试藻液；实验在250mL的锥形瓶中进行，将受试藻液分成实验组和对照组，每组100mL，在实验组藻液中按体积比1:1加入待测水样，在对照组藻液中按体积比1:1加入空白水样，即蒸馏水；实验组和对照组设定3个平行样，培养过程中，每天摇动锥形瓶1次，通过改变锥形瓶在光照培养箱中的位置，尽量保持实验组与对照组的培养环境一致；(2)多荧光参数的毒性测试反应终点建立①快相叶绿素荧光测量快相叶绿素荧光的测量采用英国Chelsea公司高速重复脉冲式荧光仪FASTflow，测量过程中，高速脉冲光激发光合系统II的反应中心产生大量电子，阻塞电子传递链，关闭光化学反应，产生快相叶绿素荧光；由于光合过程电子传递过程中电子受体Q_A和PQ的氧化还原周期不同，可以通过调节FASTflow激发光时序控制传递链电子阻塞位置，实现单周转和多周转两种模式激发；②快相叶绿素荧光分析单周转激发模式ST：使用高强度和高频率激发脉冲光在Q_A单个光化学周转120‑160μs内将其全部还原，在Q_A处形成电子堆积，打断光合作用的电子传递链，产生ST快相叶绿素荧光，利用(1)‑(3)式可拟合和推算出PSII的有效吸收截面σ_PSII、电荷分离效率Φ_q和最大光量子效率Δφ_sat；Φ_q＝(F_m‑F_a)/(F_m‑F_o)     (2) Δφ_sat＝(F_m‑F_o)/F_m＝k· n_PSII     (3)其中，F_n为第n个脉冲激发的荧光强度，E_n为第n个激发脉冲的强度，Δτ为激发脉冲间隔；τ_dec为可变荧光衰减时间常数，F_o为本底荧光，F_a为环境光照下的荧光产率，F_m为反应中心 完全关闭时的最大荧光，n_PSII为有效光合反应中心数量，k为常数；多周转激发模式MT：使用低频脉冲光在60‑500ms时间内提供激发能量，使Q_A发生更多氧化还原反应，将电子传递到PQ池，在PQ重新氧化前形成电子累积，阻塞光化学反应的能量传递，产生MT快相叶绿素荧光，利用(4)式可推算出PSII到PSI的电子转移效率Φ_e；式中为单周转激发模式下最大荧光、为单周转激发模式下本底荧光、为多周转激发模式下最大荧光、为多周转激发模式下本底荧光；③毒性测试的反应终点建立依据生物能流理论，捕光色素LHCII吸收光能后，通过色素间能量传递将能量转移至有效光合反应中心RCII，激发反应中心叶绿素a分子，激发态叶绿素a分子共有三种去活化途径：参与光化学反应、热能的形式散失H和向外辐射荧光F，光化学反应过程是利用激发能进行原初电荷分离，产生电子，电子经电子传递链Q_A、Q_B和PQ传递给光合系统I，最终转化为固定二氧化碳的同化力，即ATP和NADPH参与暗反应，从能流角度分析，参与光化学反应能量P与有效光合反应中心数量n_PSII，有效吸收截面σ_PSII、电荷分离效率Φ_q、电子转移效率Φ_e线性相关，因此，在强度为I的光辐射下，P大小按(5)式推算；P＝I· n_PSII·σ _PSII·Φ_q·Φ_e＝I·k·σ _PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat   (5)藻类光合作用速率Ψ是细胞吸收利用外界光能的效率，具体计算如(6)式所示；Ψ是光合系统对光能的吸收、传递和转化效率的线性叠加，全面反映了光合作用的能量传递过程，能够响应对光合系统作用位点和作用方式不同的物质毒性，因此，以Ψ作为毒性测试的反应终点，能够有效测试重金属、农药和有机污染物质毒性；Ψ＝P/I＝k·σ _PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat   (6)(3)综合毒性强度与藻类光合作用抑制率间的剂量‑效应关系建立①配制标准毒性参比物采用国际经合组织和美国环保局制定的化学品毒性检测标准方法藻类生长抑制试验作为物质毒性评价的标准方法，以毒性稳定的HgCl₂溶液作为毒性参比物，进行藻类生长抑制试验，按(7)‑(8)式计算藻类的生长抑制率；以96小时50％的生长抑制率的半数有效浓度EC_50‑96作为1个综合毒性当量，获得HgCl₂溶液单位浓度的综合毒性强度；μ_i‑j＝(lnX_j‑lnX_i)/(t_j‑t_i)   (7) 式中μ_i‑j为从i时间到j时间的比生长率；X_i和X_j分别为i和j时间的生物量；I_r＝(μ_C‑μ_T)/μ_C×100    (8) 式中I_r为以比生长率为基础的抑制率，％；μ_C为对照组各平行样藻类比生长率的平均值；μ_T为实验组各平行样藻类比生长率的平均值；②建立综合毒性强度和藻类光合作用抑制率间的剂量‑效应关系将HgCl₂毒性参比物分别配制成多个浓度梯度的被试物质溶液，并以相应溶剂做空白对照，等剂量加入到受试藻液，形成多个综合毒性强度梯度的实验组和对照组，培养24小时后，测量快相叶绿素荧光曲线，计算出实验组的Ψ和对照组的Ψ，利用(9)式计算出藻类光合作用抑制率I_g；采用对数阻滞增长模型拟合综合毒性强度T与藻类光合作用抑制率I_g之间的剂量‑效应关系如(10)式所示；式中：I_g为藻类光合作用抑制率；I_gmin为完全抑制综合毒性强度对应的藻类光合作用抑制率；I_gmax为空白对照组对应的藻类光合作用抑制率；T为综合毒性强度；EC₅₀为I_r对应的半数效应综合毒性强度，通过模型参数率定方式获得；m为T等于EC₅₀时拟合曲线斜率；(4)水体综合毒性强度定量检测按(11)式计算出样品综合毒性强度T，待测水样检测结果取三个平行样综合毒性强度的平均值