周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒。根据测序结果分析，推测其氨基酸序列，然后利用相关的软件预测它们的B细胞表位和T细胞表位，制备出周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因疫苗。将该疫苗免疫接种BALB/c小鼠，并检测其疫苗的体液免疫和细胞免疫的应答效果。试验结果证明了该疫苗可诱导小鼠产生特异性的免疫应答反应，取得满意效果，制备周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因疫苗获得成功。

主权项

一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：(一)引物设计根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入Xho Ⅰ/BamH Ⅰ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’下划线序列为BamHⅠ酶切位点 Tm＝56.84℃P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点 Tm＝66.90℃(二)周期型马来丝虫虫体及微丝蚴的收集和总RNA的提取和测定(1)将取自长爪沙鼠腹腔液的成虫及微丝蚴移入1.5ml匀浆器中,加入1mlTrizol试剂研磨,室温静置5min；(2)加入0.2ml氯仿,震荡15s后静置2min,4℃,12000rpm离心15min取上清；(3)加入0.5ml异丙醇混匀,室温静置10min,4℃,12000rpm离心10min弃上清；(4)加入1ml 75％乙醇混匀,4℃,9000rpm离心5min弃上清；(5)干燥5min后溶于DEPC处理水30ul,60℃10min；(6)取2ul总RNA稀释200倍,在紫外分光光度计上测OD260和OD280值,确定其浓度和纯度,并进行甲醛电泳检测；(三)cDNA的合成(1)取总RNA 5ul,后加入10mM dNTPmix 1ul,0.5ug/ul oligo(dT)12‐18ul,DEPC处理水3ul,65℃加热5min,后冰浴5min；(2)另取10×Buffer 2ul,25mM MgCl2 4ul,0.1M DTT 2ul,RNA酶抑制剂1ul混匀,42℃孵育2min；(3)将步骤(2)混合液加入步骤(1)物质中混匀,再加入1ul逆转录酶Superscript Ⅱ混匀；42℃孵育50min,70℃15min终止反应,‐70℃保存备用；(四)PCR扩增Bm‐myosin基因P1的Tm＝56.84℃,P2的Tm＝66.90℃,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix 4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；混匀在DNA扩增仪PTC‐100上进行PCR；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(五)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化(1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物；(2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,然后分装到1.5ml Eppendorf管，4℃离心,8000rpm 5min；弃上清,加入冰浴0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm 5min,弃上清,加入冰浴0.1mol/L CaCl₂‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用；(3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h；(4).转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min；将培养物100ul涂在含有X‐gal,IPTG,Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养；(六)阳性重组克隆的筛选和鉴定(1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒；(2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1、P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1、P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamH Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；(七)Bm‐MYOSIN二级结构预测分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredic、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构；(八)Bm‑MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；(九)Bm‐MYOSIN T细胞表位预测(1)人源HLA Ⅰ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLA Ⅰ类分子结合肽，保留输出的结果；(2)鼠源MHC Ⅰ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHC Ⅰ类分子；预测MHC Ⅰ类分子结合肽，保留输出的结果；(3)人源HLA Ⅱ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301、HLA‐DRB1*1501，预测HLA Ⅱ类分子结合肽，保留输出的结果；(4)鼠源MHC Ⅱ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHC Ⅱ类分子结合肽，保留输出的结果；(十)表位基因片段的选择根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp‐1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29；应用Primer 5软件设计引物；上游P1：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’其中GGATCC为BamH Ⅰ酶切位点；下游P2：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT其中GAATTC为EcoR Ⅰ酶切位点；引物使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L；(十一)表位基因片段PCR扩增(1)以pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系：PCR扩增反应体系扩增反应参数为：取5μl样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因；(十二)目的基因与载体连接与鉴定A、PCR产物及pET‐28a(+)载体质粒双酶切体系：双酶切反应体系目的基因与载体连接，具体反应体系:目的基因与载体连接反应体系混匀，室温反应30min以上，产物用于转化；B、E.coli DH5α感受态细胞的制备(1)用接种环取保存于‐80℃DH5α菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养14‐16h至单菌落出现；(2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37℃振荡培养10‐12h；(3)取1ml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37℃振荡培养2‐2.5h，到OD值达0.5，冰浴5‐10min；(4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4℃，1600rpm离心7min；(5)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，4℃，1100rpm离心5min；(6)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4℃，1100rpm离心5min；(7)用2ml冰冷的0.1M CaCl₂溶液重悬细胞，分装后15％甘油冻存于‐80℃；C、转化及鉴定(1)取100μl贮存于‐80℃钙化菌，冰浴化开；加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；(2)热休克，42℃水浴30‐90s，勿动；(3)快速转移到冰浴中，冷却1‐2min；(4)加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37℃，100rpm振荡培养45min；(5)5000rpm离心1min；(6)弃部分上清，混匀后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体被吸收，37℃温箱倒置培养12‐16h；(7)用白枪头挑单克隆至5ml含Amp的LB液，37℃，220rpm振荡培养12‐16h，至OD值在0.6‐0.8之间；(8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应；(9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定；(10)选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后进行测序；(十三)BmM29表位基因真核表达载体构建纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的克隆位点；目的基因和载体的摩尔比为5:1,反应体系25ul,16℃水浴连接过夜；取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于LB‐Amp平板上,其中每mlLB中含Amp100mg，37℃过夜培养；从LB‐Amp平板上随机挑取单个菌落,分别接种于LB‐Amp培养基中,37℃振荡过夜培养,提取重组质粒,经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切,后1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(十四)BmM29表位基因疫苗免疫应答试验A.pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)‐BmM29质粒大量抽提(1)取100ml过夜培养的菌液加入50ml离心管，12000rpm离心3min收集细菌，尽量弃尽上清；(2)12000rpm离心3min，用移液器把剩下的少量液体吸出；(3)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液1，使用涡旋振荡器和移液器让细胞悬浮，无小菌块；(4)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液2，立即温和地上下翻转6‐8次，室温静置5min；(5)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液4，立即温和地上下翻转6‐8次，室温静置10min，12000rpm离心20min，将溶液全部倒入过滤柱中，慢慢推动推柄，滤液收集在50ml离心管中；(6)向滤液中加8ml异丙醇，混匀后转移到吸附柱，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液；(7)向吸附柱中加3ml去内毒素缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液；(8)向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液；重复一次；(9)将吸附柱重新放回收集管，12000rpm离心5min，去除吸附柱中残余的液体；(10)吸附柱置于干净的50ml收集管，加1ml洗脱液TE，室温静置5min，12000rpm离心2min；(11)用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为1mg/ml，‐20℃保存备用。