一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法

摘要

本发明公开了一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法以及相关基因的鉴定和验证方法，发明人利用MS‑AFLP技术并结合统计学技术，通过不同温度和不同时期的胁迫处理，对DNA甲基化的变化规律进行了系统性的分析，总结了利用ChIP‑qPCR和qPCR技术对该分析过程和鉴定到的基因进行验证。本发明针对非模式植物，特别是极端生境下的植物类群的DNA甲基化研究提供了有效的参考，首次将气候环境变化与DNA甲基化修饰变化联系在一起进行系统的分析。相对于其他表观遗传学研究，药品廉价易得，成本低。所选分析软件容易操作，方法简便。并对结果进行验证，体系完整。

主权项

一种高山冰缘植物高山离子芥低温胁迫下DNA甲基化的分析方法，其特征在于：通过对高山冰缘植物高山离子芥两种不同低温的胁迫处理，观察抗冻性的差异，同时调查DNA甲基化的变化模式，从而发现DNA甲基化随不同冷胁迫强度和不同胁迫时间的变化规律，鉴定不同时期受DNA甲基化调控的相关基因，进行鉴定，分离和克隆，最后利用基因组ChIP‑qPCR和转录本qPCR对结果进行验证；其中所述两种不同的低温胁迫处理，是指在4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，在﹣4℃下处理0.5小时，3小时，12小时和24小时，从正午12点整开始计算时间，同时在适宜温度下正常生长的离子芥再生苗作为对照组，同时进行取样；包括以下步骤：<1>冷胁迫处理选用长势均一的离子芥再生苗，通过在4℃和﹣4℃下不同程度的冷胁迫处理，观察不同胁迫强度下的损伤程度，通过电导率和叶绿素测定进行量化；<2>提取DNA分别提取步骤<1>的两个处理组和一个对照组的DNA；<3>提取RNA分别提取步骤<1>的两个处理组和一个对照组的RNA；<4>MS‑AFLP分析步骤<2>中各处理基因组和对照组DNA分别进行Hpa II和EcoRI 酶切过夜，酶切产物搭配特定引物进行选择性扩增，采用变性聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物；将扩增的产物进行1％琼脂糖电泳，切割下特异性条带回收，利用pMD18 T载体试剂盒将特异性条带连入T载体中，将测定序列在NCBI上比对，比对结果进行分析；<5>数据分析将扩增条带的有无赋值为0/1，建立0/1矩阵，建立基于R语言的统计工具的广义线性模型Generalized Linear Model，来评估DNA甲基化在不同的冷冻胁迫温度和每个时间点的变化程度；基于past统计工具对DNA甲基化的变化规律进行非度量多维度NMDS的多重二维分析，来分析和阐明DNA甲基化在不同冷冻胁迫温度下随时间的变化模式；基于canoco统计工具对DNA甲基化的变化规律进行主成分分析PCA，来使得DNA甲基化的分异模式可视化，发现DNA甲基化在不同低温胁迫的变化规律，最后整个结果进行随机的CHIP‑qPCR和转录本qPCR的验证。