一种自体外周血淋巴细胞DC‑CIK的培养方法

摘要

本发明涉及一种自体外周血淋巴细胞DC‑CIK的培养方法，包括如下步骤：（1）外周血单个核细胞的分离；（2）DC细胞的分离培养；（3）CIK细胞的诱导培养；（4）DC和CIK的共培养制备DC‑CIK细胞，并添加CTLA‑4mAb 100ng/mL、PD‑1mAb 100ng/mL；(5)离心收集培养的DC‑CIK细胞。本发明通过向无血清培养基中添加多种单抗及细胞因子，提高效应细胞群活化效率和扩增效率。特别是体外加载CTLA4 抗体、PD‑1抗体以覆盖所有CIK细胞表面的CTLA4、PD‑1分子,使其不能和DC上相应受体结合，有效的降低了T调节细胞的含量，进一步提高CIK细胞对肿瘤的杀伤作用。

主权项

一种培养自体外周血淋巴细胞DC‑CIK的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外周血单个核细胞的分离：从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X‑VIVO15无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为(1～2)×10⁶个/mL，静置培养2小时；(2)DC细胞的分离培养：从步骤(1)中制得的培养液中吸出悬浮细胞；贴壁细胞加入含有rhGM‑CSF 1000U/mL、rhIL‑4 500U/mL的X‑VIVO15无血清培养基15mL，静置培养；第3天半量换X‑VIVO15无血清培养基，并补加rhGM‑CSF1000U/mL、rhIL‑4 500U/mL；第5天加入肿瘤特异性抗原50μg/mL刺激；第6天加入rhTNF‑α500U/mL,继续培养到第7天；(3)CIK细胞的诱导培养：从步骤(2)中所述的吸出的悬浮细胞静置培养；第3天后加X‑VIVO15无血清培养基至100mL，同时添加IL‑2 1000U/mL；第4天加X‑VIVO15无血清培养基至240mL，同时添加IL‑2 1000U/mL，培养至第7天；(4)DC和CIK的共培养制备DC‑CIK细胞：将步骤(2)和步骤(3)所培养的DC、CIK细胞混合，将混合后的细胞转移至1.8L培养袋中，加X‑VIVO15无血清培养基至1000mL，同时添加IL‑2 1000U/mL，CTLA‑4mAb 100ng/mL、PD‑1mAb100ng/mL，静置培养5‑7天；(5)离心收集成熟DC‑CIK细胞：第14天将培养好的DC‑CIK细胞离心收集，并用0.9wt％氯化钠溶液洗涤2次，将收集好的细胞加入体积百分比为20％的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt％氯化钠溶液定容至100mL。