主权项 |
牙鲆正常和白化皮肤细胞系的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一:配制细胞培养液:取DMEM/F12培养基和Hepes,充分溶解混合均匀4h后,用NaOH调节pH值,然后抽滤,将滤液分装,于4℃保存,使用时,取滤液加入胎牛血清、50mm的2‑巯基乙醇、10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、100U/ml青霉素、0.1mg/ml硫酸链霉素,并于4℃存放,所述胎牛血清的体积为DMEM/F12培养基体积的20%;步骤二:原代培养:首先配置冲洗液,所述的冲洗液包括DMEM/F12培养基、100U/ml青霉素和0.1mg/ml硫酸链霉素,然后分别取体重200克正常牙鲆和白化牙鲆,分别用MS‑222麻醉之后,用70%酒精浸泡清洗4min,取正常牙鲆、白化牙鲆的有眼侧皮肤分别置于不同的细胞培养皿中,使用冲洗液冲洗三次,将皮肤组织剪成1mm<sup>3</sup>的小块后,分别放入25cm<sup>2</sup>的培养瓶中,向培养瓶中补充细胞培养液至完全覆盖皮肤组织块,并正置于24℃的培养箱中培养,最后每隔5天更换细胞培养液一次;步骤三:传代培养:原代培养细胞开始迁移增殖后,细胞数目增多,细胞生长成为单层后,采用0.25%胰酶消化法传代悬起细胞,并以1:1—1:2进行传代,以后8‑10天传代一次,传至第10代时,细胞培养液中胎牛血清含量减为总体积的10%,此时,细胞系建立成功。 |