转化外源ssRNA到米根霉休眠孢子中并表达蛋白质的方法

摘要

本发明公开了转化外源ssRNA到米根霉休眠孢子中并表达蛋白质的方法，包括米根霉培养和孢子收集、米根霉孢子预处理以及使用HDEN法电击米根霉孢子三个步骤，该方法绕过真菌孢子萌发这个步骤，采用HDEN电转化技术，将体外的单链编码蛋白RNA递送穿过细胞壁和细胞膜，在米根霉休眠孢子内表达蛋白质。本发明方法步骤简便快速，效果极佳，转化率达到90%以上。

主权项

转化外源ssRNA到米根霉休眠孢子中并表达蛋白质的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）米根霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种米根霉，培养至培养基表面长满米根霉孢子，洗下培养基表面的米根霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；2）米根霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3‑4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为10⁴‑10¹¹个/ml的米根霉孢子悬液；所述电击缓冲液由终浓度为0.01‑100mmol/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5‑5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0‑9.5；3）使用HDEN法电击米根霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的米根霉孢子悬液以及待转化RNA，混匀，得到孢子与RNA混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后采用Etta Biotech X‑Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部，通电，使得孢子与RNA混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后将孢子和RNA混合物吸出，得到导入外源ssRNA的休眠的米根霉孢子；所述米根霉悬液与待转化RNA的比例为：0.6‑60000μl的米根霉孢子悬液：0.1‑10000μg的待转化RNA；所述电击参数如下：电压1‑6000V，脉宽2‑2000000ms，重复1‑100次，每次间隔5‑50000ms。