一种镍螯合型免疫复合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种镍螯合型免疫复合物及其制备方法和应用，该镍螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：镍离子结合于免疫复合物形成的复合物，或镍离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或镍离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。本发明所述镍螯合型免疫复合物可用于检测地区人群血清中是否镍螯合型免疫复合物及含量，间接反映这个地区镍污染程度。

主权项

一种镍螯合型免疫复合物，其特征在于，该镍螯合型免疫复合物为镍离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；所述镍螯合型免疫复合物通过以下步骤制备而成：A）合成镍螯合型免疫复合物的步骤，具体如下：（1）配制螯合剂：将螯合剂溶于溶剂中，配制成螯合剂溶液；（2）配制载体蛋白溶液：将载体蛋白加入到硼酸盐溶液中，得到载体蛋白溶液；（3）搅拌过夜：将步骤（1）的螯合剂溶液加入到步骤（2）的载体蛋白溶液中，搅拌后于摇床中作用2‑30h，得到混合液；（4）透析袋预处理：在透析袋中加入EDTA‑NaHCO₃溶液煮沸，弃废液后用ddH₂O冲洗；重复该步骤1‑3次；（5）透析：将步骤（3）的混合液装入经步骤（4）处理后的透析袋中，用ddH₂O透析，换水2‑3次，4℃透析过夜之后，收集液体；（6）镍离子螯合：在上述步骤（5）中的液体中加入HCl溶液调整pH至7.0，缓慢加入镍盐溶液，边滴加边振荡，之后于摇床中作用2‑30h，然后将得到的液体装入经步骤（4）处理后的透析袋中，用ddH2O透析，换水2‑3次，4℃透析过夜之后，收集液体，得到镍螯合型抗原；（7）在上述镍螯合型抗原中加入能与载体蛋白特异性结合的抗体反应后得到镍螯合型免疫复合物；B）提纯镍螯合型免疫复合物的步骤：采用免疫亲和层析法去除步骤A）合成的镍螯合型免疫复合物中未参与反应的载体蛋白、和该载体蛋白特异性结合的抗体及镍离子，具体如下：（a）将上述A）步骤合成的镍螯合型免疫复合物复溶于生理盐水中，得到镍螯合型免疫复合物溶液；（b）层析柱预处理：使用稀释缓冲液冲洗管路，在层析柱中装入能与免疫复合物特异性结合的填料，装柱后继续用稀释缓冲液平衡柱子；（c）上样：待柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释上述（a）步骤得到的镍螯合型免疫复合物溶液，然后上柱，镍螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的载体蛋白、抗体、镍离子随稀释缓冲液流出；（d）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0.05‑0.10mol/L的Na₂HPO₄溶液进行洗脱；（e）收集：收集步骤（d）中洗脱处理后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（f）将经过步骤（e）收集到的洗脱液装入透析袋用ddH₂O透析除盐，换水2‑4次后，多次4℃透析过夜，收集样本；（g）层析柱预处理：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡柱子；（h）上样：待步骤（g）的柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释上述步骤（f）的样本，然后将稀释后的样本上柱，镍螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的抗原抗体复合物会随稀释缓冲液流出；（i）洗脱：步骤（h）之后用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0.5‑1.0mol/L的Na₂HPO₄进行洗脱；（j）收集：收集步骤（i）洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（k）将步骤（j）收集到的洗脱液装入透析袋用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得到纯化的镍螯合型免疫复合物。