主权项 |
一种苯胺绿人工抗原的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1) 制备人工半抗原:(a) 将N,N‑ 二甲基苯胺和4‑ 羧基苯甲醛以摩尔比为2:1的比例加入圆底烧瓶中,100℃下搅拌反应6小时;反应结束后反应液用乙醚提取,转干,经重结晶得到白色固体产物Ⅰ;(b) 称取2g产物Ⅰ,加入苯30ml以及5gAmberlyst 15树脂催化剂的,放入圆底烧瓶中,在氮气保护、130℃下回流搅拌过夜;反应结束后,将溶剂减压转干,用乙醚提取得产物Ⅱ;(c) 将产物Ⅱ经硅胶柱层析纯化,提取得到苯胺绿半抗原4‑(双(4‑ 二甲胺基)苯基)甲基苯甲酸(4‑MGC)白色固体;(2) 制备苯胺绿人工抗原:(d) 称取0.425g 半抗原和N‑ 羟基琥珀酰亚胺0.225g,溶于10.0mlN,N‑ 二甲基甲酰胺中,再慢慢滴加溶解有0.255g N,N‑ 二环己基碳二亚胺的10.0ml N,N‑ 二甲基甲酰胺,边滴加边磁力搅拌,结束后20℃磁力搅拌过夜,得到A液;(e) 将牛γ球蛋白溶于PBS缓冲液中,得到浓度为5mg/ml的B液;(f) 在常温磁力搅拌条件下,将A液逐滴加入到10ml的B液中,得到人工抗原混合液,4℃冰箱内磁力搅拌过夜;(g) 制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4;(h) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析,4℃搅拌透析,每4小时换一次缓冲液,透析2天, 紫外扫描透析液无小分子吸收峰时,将产物离心取上清,在无菌条件下通0.2μm 的滤膜,即得到苯胺绿人工抗原:苯胺绿‑牛γ球蛋白。 |