人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法

摘要

本发明涉及一种人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，主要包括培养液配制、培养瓶处理、扁桃体组织取材、扁桃体组织分组消化比较、扁桃体上皮细胞的分离、形态学观察、免疫荧光鉴定等步骤。本发明对口腔上皮细胞的分离技术进行改进，探讨出了一种成功率较高、步骤简单、纯化率高的，几乎不会出现污染的扁桃体上皮细胞的体外分离及培养技术，其应用于人扁桃体上皮细胞的体外培养和纯化过程，对后续EB及其它病毒在扁桃体中的作用机制研究具有重要意义。

主权项

人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于：步骤如下：一、实验准备：(1)培养液配制:采用K‑SFM培养基，加入表皮生长因子、牛垂体提取物、CaCl₂、青霉素‑链霉素混合液和两性霉素，混匀，过滤，保存；(2)培养瓶处理；向培养瓶中加入Type I/III胶原，以没过培养瓶底部为宜，在生物安全柜中避光通风过夜，次日在紫外灯下照射，保存备用；二、分离培养(1)扁桃体组织取材：在生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的冰浴培养皿中，去除周边结缔组织，清洗，剪成组织块，并将其转移至dispase grade II溶液中；(2)扁桃体组织分组消化：孵育过夜；(3)扁桃体上皮细胞的分离：将消化好的组织块于次日经细胞筛过滤，细胞悬液离心、弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬、消化；然后加入含有血清的K‑SFM培养基，中止消化，再离心、弃上清，最后用K‑SFM培养基重悬，将原代细胞种入培养皿中，静置培养；(4)形态学观察：将不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较；(5)免疫荧光鉴定：包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定：待培培养皿中的细胞密度达到70％‑90％，弃去培养液，加入固定液固定，弃去固定液后用TritonX‑100通透化处理，然后用BSA封闭；加入一抗，过夜；加入荧光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育，然后用DAPI染色，在荧光显微镜下观察。