一种纳米材料诱导DNA损伤的检测装置及快速检测方法

摘要

本发明提供了一种纳米材料诱导DNA损伤的检测装置，主要包括可供细胞贴壁生长并且能直接在激光共聚焦显微镜上成像的多孔腔室；一个嵌套在腔室内可选择性透过并可支持细胞生长的滤膜。通过此装置，可将不同粒径的纳米材料以及纳米材料与溶解析出的离子分开，也可以将能透过细胞膜的纳米材料和不能够透过细胞膜的纳米材料分开，从而有助于明确纳米材料在水环境中的迁移、转化影响其遗传毒性的决定机制。本发明还提供了一种纳米材料诱导DNA损伤的快速检测方法，主要包括以下步骤：将细胞均匀种在装置内，与待检测的纳米材料共孵育；暴露后细胞用多聚甲醛固定；并通过TNBS溶液处理增加细胞膜通透性；利用DNA损伤标志性产物γ‑H₂AX特异性荧光抗体，结合共聚焦显微成像技术或流式细胞术，对“转化态”纳米材料引发的单细胞内DNA损伤进行快速、定位、定量检测。

主权项

一种纳米材料诱导DNA损伤的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1.取一皿满度生长的哺乳动物细胞，经胰蛋白酶酶解后统计细胞总数；2.取带若干个腔室玻片的细胞培养板，每个腔室玻片上种一定数量的细胞，连续培养48小时待细胞进入对数生长期；或取若干个细胞培养皿，每个细胞培养皿内种一定数量的细胞，连续培养48小时待细胞进入对数生长期；3.细胞进入对数生长期后，将纳米材料与培养基混合后再与细胞共孵育；4.孵育一定时间后，去除条件培养基，用磷酸盐缓冲液PBS漂洗细胞3‑5遍；5.每个腔室玻片中的细胞用1ml 2％‑5％的多聚甲醛溶液室温固定20分钟；或者将培养皿中的细胞酶解下来后，每皿细胞再用1ml2％‑5％的多聚甲醛溶液室温固定20分钟；6.固定完成后去除多聚甲醛溶液，用PBS漂洗细胞3‑5遍；7.每皿细胞加入1ml TNBS溶液室温作用45分钟，所述TNBS溶液按照体积百分比组份为0.5％‑1.5％胎牛血清、0.1％‑0.5％Triton X‑100、98％‑99％PBS；8.将抗γ‑H₂AX的一抗按1:200‑1:1000稀释到含1％胎牛血清的PBS中，混匀后与细胞于室温孵育60分钟；9.一抗标记完成后，用TNBS溶液漂洗3‑5遍，每遍5分钟；10.将FITC连接的羊抗兔IgG的二抗按1:200稀释到含1％胎牛血清的PBS中，混匀后与细胞于室温孵育60分钟；11.二抗标记完成后，用TNBS溶液漂洗3‑5遍，每遍5分钟；12.将10μg/ml的Hoechst 33342溶液与细胞于室温孵育20分钟；13.用TNBS溶液漂洗3‑5遍，每遍5分钟；14.加入甘油碳酸缓冲液，4℃暗盒保存，至共聚焦显微镜成像或者用流式细胞仪检测。