利用含有羟化酶的发酵液生产11α-羟基坎利酮的方法

摘要

本发明涉及一种利用羟化酶通气转化生产11α‑羟基坎利酮的方法，属应用微生物技术领域。主要为解决在分批发酵中步骤繁琐、转化产物吸附于菌丝体难以分离纯化等问题。将可以产羟化酶的菌种加入到培养基中，培养一段时间待菌体生长粗壮后，对菌丝体进行超声破碎，然后进行离心，得到的上清液即为转化所需酶液。将一定浓度溶于N,N‑二甲基甲酰胺（DMF）的坎利酮溶液，加入到酶液中，通入无菌空气、保持搅拌和一定温度进行转化，转化结束后用乙酸乙酯萃取反应液，萃取液进行减压蒸干，得到的干物质即为转化后的粗产物。该工艺步骤简单，效率高，成本低，时间短。

主权项

利用含有羟化酶的发酵液生产11α‑羟基坎利酮的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)斜面菌种制备：生产菌种为根霉Rhizopus sp.UJS‑0602，将该菌接种到斜面培养基，25‑31℃环境条件下恒温培养4‑8天后，待其表面布满孢子，然后转接到斜面培养基上，25‑31℃环境条件下继续恒温培养4‑8天后，待其表面布满孢子后，即得生产斜面；(2)孢子悬浮液制备：无菌条件下，将无菌水加入到生产斜面，洗下孢子，用无菌水调节孢子液，以得到浓度为10⁶‑10¹⁰cfu/mL的孢子悬浮液；(3)摇瓶种子制备：将孢子液加入装有50‑150mL新鲜无菌培养基的500mL三角瓶中，接种量1‑10％，25‑31℃、摇床转速150‑220r/min条件下培养12‑48h后，制得种子液；(4)种子液制备：将所得的摇瓶种子接入培养基经过灭菌的一级种子罐中，接种量1‑10％，通入无菌空气培养，通气量为0.1‑2.0v/v/m，搅拌转速为50‑500r/min，控制温度为28‑31℃，培养12‑48小时后即得一级种子；将所得的一级种子接入培养基经过灭菌的二级种子罐中，接种量1‑10％，通入无菌空气培养，通气量为0.1‑2.0v/v/m，搅拌转速为50‑500r/min，控制温度为28‑31℃，培养12‑48小时后即得二级种子；(5)羟化酶液制备：将所得的二级种子接入培养基经过灭菌的机械搅拌发酵罐中，接种量1‑10％，通入无菌空气培养，通气量为0.1‑2.0v/v/m，搅拌转速为50‑500r/min，控制温度为28‑31℃，培养12‑60小时后即得发酵液；将制得的发酵液在无菌条件下，进行超声处理，超声频率：1‑10kHZ，超声时间5‑30min；然后1000‑15000r/min离心20‑60min，所得上清液即为酶液；(6)加坎利酮通气转化：将所得的酶液置于经过空消灭菌的机械搅拌发酵罐中，加入坎利酮，使坎利酮在混合液中的浓度为0.1‑10g/L，通入无菌空气进行转化，通气量为0.1‑2.0v/v/m，搅拌转速为50‑500r/min，控制温度为28‑31℃，转化24‑108小时后结束；用等体积乙酸乙酯对所得转化液进行萃取，高效液相检测所得11α‑羟基坎利酮，纯度达90.0‑99.5％；其中，所述的发酵液培养基组分包括：葡萄糖15.0‑25.0g/L，酵母膏14.5‑20.0g/L，玉米浆30.0‑35.0g/L。