利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法

摘要

本发明涉及一种生物工程技术，具体地说是一种利用基因重组病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法：重组慢病毒载体构建；神经干细胞的分离、培养及鉴定；重组病毒转染NSCs；重组慢病毒转染NSCs的鉴定；重组病毒转染NSCs：取传代3次后的NSCs消化制备成单细胞悬液，接种至培养板中；转染TH+Brn4基因重组慢病毒；加入慢病毒和ploybrene，摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基；同时用嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞；本发明的优点在于：通过构建目的基因TH和Brn4的慢病毒载体，转染NSCs后外源性基因能在细胞内稳定表达；分化后产生高比例的TH阳性多巴胺能神经元；Brn4能促进神经营养因子的高表达，且具有抑制细胞凋亡的功能。

主权项

利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，所述的方法包括如下实施步骤：一、pLV5‑TH+Brn4重组慢病毒载体构建：根据pLV5‑EF1a‑GFP慢病毒表达载体的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全长序列分别为NM_012740和NM_017252的基因，构建pLV5‑TH、pLV5‑Brn4和pLV5‑TH+Brn4慢病毒表达载体，包装后进行测序鉴定和滴度鉴定；二、神经干细胞的分离、培养及鉴定：神经干细胞的培养方法：在无菌条件下，以孕14d的SD胎鼠腹侧中脑组织为原材料，用吸管反复吹打直至为细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，收集过滤后的细胞悬液，用基础培养基清洗3遍后重悬于NSCs培养液中，经细胞计数和活力观察后，按1×10⁵/ml细胞密度接种于含有10ml NSCs培养液的细胞培养瓶中，置于5％、37℃的CO2培养箱中培养，3天后可见培养瓶内形成悬浮的NSCs球，7天后进行传代培养；神经干细胞的分离方法：神经干细胞在培养瓶中培养3天后，用低速离心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶进行消化，10min后用含10％FBS的基础培养液终止消化，通过机械吹打的方式使其分散成单细胞悬液，进行细胞计数后培养瓶中继续培养；神经干细胞的鉴定方法：取P3代NSCs在传代时培养液中加入终浓度为5μmol/L的BrdU进行标记，使BrdU整合到神经干细胞DNA中，7天后进行BrdU免疫荧光检测；另取P3代以后的NSCs亚克隆球用Nestin免疫荧光检测证明其胚胎源性；将P10代NSCs球接种于预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中，加入含10％FBS的DMEM/F12分化培养液进行分化，2周后分别进行MAP‑2、GFAP和CNP免疫荧光检测以证明NSCs的多分化潜能；三、重组病毒转染NSCs：所述的重组病毒的转染方法：取P3代NSCs消化制备成单细胞悬液，细胞计数后接种至24孔培养板中，每孔接种4×10⁴个细胞，加入500μl基础培养液悬浮细胞；细胞共分4组进行转染，每组6孔：Mock组转染pLV5‑GFP慢病毒阴性对照；TH组转染pLV5‑TH重组慢病毒；Brn4组转染pLV5‑Brn4重组慢病毒；TH+Brn4组转染pLV5‑TH+Brn4重组慢病毒；每孔加入20μl 1×10⁸TU/ml的慢病毒和5μg/ml ploybrene，轻轻摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基；感染72小时后，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，同时在培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞；7天后对各组形成的NSCs球进行传代培养；四、重组慢病毒转染NSCs的鉴定，包括：转染效率检测是将转染后的NSCs球接种至预涂有多聚赖氨酸圆盖片的24孔板中，加入含2％FBS的DMEM/F12分化培养液，分化培养1周后终止培养，吸去培养液，加入4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hoechst33342染色，在荧光显微镜下观察结果；TUNEL法细胞凋亡检测是将各组NSCs分化培养2周后，吸去各孔中的培养液，用0.01M PBS清洗3遍，然后用含4％多聚甲醛的0.1PBS室温下固定20min,吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用TUNEL凋亡检测试剂盒按操作说明进行细胞凋亡检测,最后PBS洗片3遍后，在避光条件下，加入Hoechst33342，室温湿盒孵育30min,PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置荧光显微镜下观察TUNEL、Hoechst阳性细胞核并摄片；用统计方法对各组数据进行方差分析和组间比较；高效液相色谱法检测分化培养液中DA含量是将各组取NSCs分化培养液1ml，加入0.1mol/L过氯酸酸化培养液，14000rpm离心15min，取上清过滤后行高效液相色谱测定，色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS‑SP型十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温40℃；流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液，磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液比例为97:3；流速为1.0ml/min；检测器为SPD‑20A型紫外检测器，检测波长280nm。