制备重组LD78β蛋白的新工艺

摘要

本发明涉及重组蛋白制备领域，具体公开了一种重组LD78β蛋白的制备工艺，利用基因工程的方法，人工合成表达重组LD78β蛋白的重组基因EK‑LD78β，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离、酶切、纯化等步骤获得重组LD78β蛋白。本发明的制备方法操作安全、简单、产品特异性高，有利于LD78β蛋白的大规模生产。

主权项

一种重组LD78β蛋白的制备工艺，具体步骤如下：1)人工合成表达重组LD78β蛋白的重组基因EK‑LD78β，所述重组基因EK‑LD78β的序列包括左右两端的限制性酶切位点序列，以及两端限制性酶切位点序列之间的、5’至3’方向依次排列的肠激酶识别位点序列和重组LD78β蛋白基因序列；其中，重组LD78β蛋白基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述重组基因EK‑LD78β序列左右两端的限制性酶切位点分别为Kpn I酶和Hind III酶的限制性酶切位点；2)重组质粒的构建：将上一步的重组基因EK‑LD78β插入载体，获得含有重组LD78β蛋白基因序列的重组质粒，其中，所述载体为pET32a(+)，所述重组基因EK‑LD78β插入到所述pET32a(+)的Kpn I酶和Hind III酶的酶切位点之间；3)基因工程菌的制备：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞制备基因工程菌，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌；4)外源基因的表达：基因工程菌发酵表达含有重组LD78β蛋白的融合蛋白；5)目的蛋白的纯化：裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组LD78β蛋白产品，并且，所述融合蛋白的酶切、纯化步骤采用四步纯化法，该四步纯化法依次为亲和层析、酶解融合蛋白、亲和层析和离子交换层析；所述四步纯化法具体步骤为：A.第一步亲和层析：Chelating Sepharose F.F.层析柱初步分离融合蛋白；B.酶解融合蛋白：用肠激酶酶切步骤A分离的融合蛋白，获得酶解液；C.第二步亲和层析：第二次采用Chelating Sepharose F.F.层析柱，纯化步骤B所得的酶解液，分离得到初步纯化的重组LD78β蛋白；D.离子交换层析：离子交换柱进一步纯化步骤C获得的重组LD78β蛋白，得到进一步纯化的重组LD78β蛋白产品。